田滋潤(rùn)， 王 燁, 韓 雪， 王蟾月， 王曉曉， 楊 浩， 朱曼麗， 李琳琳

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的主要環(huán)節(jié)[1]，是指由于營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、脂質(zhì)分布異常、感染、膿毒癥致炎癥等原因引起的胰島素敏感組織如骨骼肌、肝臟、脂肪組織等對(duì)胰島素的敏感性下降，并引起下游細(xì)胞信號(hào)通路缺陷和機(jī)體自穩(wěn)平衡失調(diào)的現(xiàn)象[2]。目前有研究顯示，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變是引起肥胖和胰島素抵抗等代謝性疾病的主要原因之一[3-5]。本研究通過(guò)高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠實(shí)驗(yàn)，對(duì)比研究胰島素抵抗成模小鼠和未成模小鼠糞便中糖脂代謝及AKK菌的變化，確定腸道菌群在胰島素抵抗形成過(guò)程中的重要性。

1 材料

1.1 儀器與試劑實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(Bio-rad IQ5 美國(guó))，凝膠成像儀(Bio-rad IQ5 美國(guó))，微量分光光度計(jì)(ND-2000，美國(guó))，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Multiskan GO,Thermo公司)。膽固醇測(cè)定試劑盒、甘油三酯測(cè)定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；糞便基因DNA提取試劑盒(凱杰，德國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，2×Tag PCR MasterMix、DNA Marker、6×Loading buffer(天根生化科技有限公司)；所用引物由新疆歐易生物公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)正常C57BL/6J小鼠，雄性，鼠齡6～8周，體質(zhì)量為18～22 g，35只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證:11400700307064。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料質(zhì)量合格證：11003800016856。動(dòng)物飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度(23±2) ℃，濕度40%～45%，每天光照12 h，單籠單只飼養(yǎng)，自主飲水。

1.3 分組35只C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常飲食對(duì)照組(normal control diet，NCD組)10只，高脂飲食組(high fat diet，HFD組)25只，飲食干預(yù)8周后，檢測(cè)各組小鼠血糖、血脂、口服葡萄糖耐量及胰島素敏感性的變化，根據(jù)HFD組檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果，從中篩選出胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和非胰島素抵抗(non-insulin resistance，N-IR)小鼠各10 只，分別為IR組和N-IR組。小鼠胰島素抵抗成模標(biāo)準(zhǔn)：小鼠胰島素耐量試驗(yàn)時(shí)小鼠40 min血糖下降百分?jǐn)?shù)<40% 納入為胰島素抵抗。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 口服葡萄糖耐量試驗(yàn) 動(dòng)物禁食8 h(自由飲水)后，尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到加有90 μL抗凝劑的1.5 mL EP管中，測(cè)定(0 min)。然后灌胃給予葡萄糖(2 g/kg體質(zhì)量)，分別于糖負(fù)荷后30、60、120 min尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到加有90 μL抗凝劑的1.5 mL的EP管中，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖，并計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)。

1.4.2 胰島素耐量實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物禁食8 h(自由飲水)后，尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到有90 μL抗凝劑的1.5 mL EP管中，測(cè)定FBG(0 min)。隨后根據(jù)小鼠體質(zhì)量(0.5 U/kg體質(zhì)量)皮下注射精蛋白鋅重組人胰島素注射液(優(yōu)泌林)；分別于胰島素注射后40、90、120 min尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到有90 μL抗凝劑的1.5 mL EP管中，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖，并計(jì)算血糖AUC及AUC下降百分?jǐn)?shù)。

1.4.3 生化指標(biāo)的測(cè)定 動(dòng)物禁食8 h(自由飲水)后，尾尖采血，用移液槍吸取10 μL血樣加入到加有90 μL抗凝劑的1.5 mL EP管中，用相應(yīng)試劑盒測(cè)定空腹血漿總膽固醇(TG)及甘油三酯(TC)。

1.4.4 糞便樣本的采集及腸道微生物總DNA的提取 分別于高脂干預(yù)前和干預(yù)第8周，用小鼠代謝籠收集小鼠的新鮮糞樣于凍存管中，-80℃保存。用糞便基因DNA提取試劑盒提取小鼠腸道微生物總DNA，用微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度與純度。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目標(biāo)菌群水平

1.4.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 擴(kuò)增AKK菌所用引物參照文獻(xiàn)[6]， 上游引物： 5′-AGAGGTCTCAAGC-GTTGTTCGGAA-3′下游引物：5′-TTTCGCTCCCCTGGCCTTCGTGC-3′，擴(kuò)增片段大小285 bp。以PCR擴(kuò)增AKK菌16SrDNA條帶為靶片段，經(jīng)切膠回收后作為目標(biāo)菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品，操作過(guò)程嚴(yán)格按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4.5.2 小鼠糞樣中目標(biāo)菌群水平的檢測(cè) 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到濃度梯度為10-1～10-8copies/μL的DNA樣本為陽(yáng)性模板，并將最后一個(gè)濃度梯度設(shè)置為起始拷貝數(shù)(LogSQ)=1,同時(shí)以去核酸水為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品都設(shè)置復(fù)孔，進(jìn)行熒光定量PCR，擴(kuò)增體系：目標(biāo)菌上下游引物各1 μL，熒光染料SYBR Green Ⅱ 12.5 μL，樣品(糞菌總DNA) 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃、3 min，變性 95℃、15 s，退火 65℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 高脂誘導(dǎo)對(duì)C57BL/6J小鼠體質(zhì)量的影響高脂誘導(dǎo)8周，與NCD組小鼠相比，IR組小鼠體質(zhì)量從實(shí)驗(yàn)第1周就明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而N-IR組小鼠體質(zhì)量從實(shí)驗(yàn)第6周才明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IR組小鼠相比，N-IR組小鼠體質(zhì)量從實(shí)驗(yàn)第1周，明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1a。

2.2 高脂誘導(dǎo)對(duì)C57BL/6J小鼠FBG及血脂水平的影響高脂飲食干預(yù)8周，與NCD組相比，IR組小鼠FBG和TC水平，明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TG水平有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；N-IR組小鼠TC水平，明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)BG和TC水平有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與IR組相比，N-IR組小鼠FBG水平，明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TC和TG水平有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 高脂飲食干預(yù)對(duì)C57BL/6J小鼠空腹血糖及血脂水平的影響

注：與NCD組比較,*P<0.05；與IR組比較,#P<0.05。

2.3 高脂誘導(dǎo)對(duì)C57BL/6J小鼠糖耐量異常的影響高脂誘導(dǎo)8周，與NCD組相比，IR組和N-IR組小鼠OGTT曲線下面積，均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但N-IR組小鼠OGTT曲線下面積增加明顯小于IR(P<0.05)，表明N-IR小鼠口服葡萄糖耐量異常程度小于IR組小鼠。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1b。

2.4 高脂誘導(dǎo)對(duì)C57BL/6J小鼠胰島素敏感性的影響高脂飲食干預(yù)8周，與NCD組相比，IR組和N-IR組小鼠ITT曲線下面積，均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明IR組和N-IR組小鼠胰島素敏感性異常；與IR組相比，N-IR組小鼠ITT曲線下面積，明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明N-IR小鼠胰島素敏感性異常程度低于IR組小鼠，未達(dá)到胰島素抵；IR組和N-IR組小鼠40 min血糖下降百分?jǐn)?shù)分別為20.36%和42.52%。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1c。

2.5 高脂誘導(dǎo)對(duì)C57BL/6J小鼠腸道AKK菌豐度的影響高脂飲食干預(yù)8周，與NCD組相比，IR組小鼠腸道AKK菌豐度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，N-IR組小鼠腸道AKK菌豐度有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與IR組相比，N-IR組小鼠腸道AKK菌豐度有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AKK菌豐度變化與小鼠的胰島素抵抗存在相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)圖1d。

注：與NCD組相比， aP<0.05； 與IR組相比， cP<0.05。圖1 高脂誘導(dǎo)對(duì)各組小鼠體質(zhì)量(a)、口服葡萄糖耐量(b)、胰島素耐量(c)、AKK菌豐度水平(d)的影響表2 高脂飲食干預(yù)對(duì)C57BL/6J小鼠口服葡萄糖和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積的影響

組別口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積0周8周胰島素耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積0周8周NCD組1 074.18±89.081 128.75±76.33607.15±83.66628.31±70.50IR組1 058.35±102.521 550.60±167.40*607.44±111.68917.11±98.76*N-IR組1 101.46±54.821 424.03±82.01*#580.78±74.24766.62±45.91*#

注：與NCD組比較,*P<0.05； 與IR組比較,#P<0.05。

3 討論

通過(guò)用高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠來(lái)誘導(dǎo)其產(chǎn)生胰島素抵抗，是本課題組研究腸道菌群與2型糖尿病關(guān)系的常用動(dòng)物模型。在前期造模過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，在同樣的飼養(yǎng)環(huán)境下，高脂飲食干預(yù)8周時(shí)，80 % 的動(dòng)物均達(dá)到胰島素抵抗模型，而有約20%的動(dòng)物仍處于非胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，此種現(xiàn)象引起了我們的注意，因此本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高脂飼養(yǎng)8周后，檢測(cè)小鼠糖脂代謝指標(biāo)水平，以胰島素耐量試驗(yàn)40 min血糖下降百分?jǐn)?shù)<40% 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出胰島素抵抗組和非胰島素抵抗組小鼠，收集它們0周和8周糞樣，運(yùn)用基于16SrRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析各組小鼠糞便中腸道菌群的變化，旨在找到與胰島素抵抗發(fā)生可能相關(guān)的靶標(biāo)菌，為腸道菌群與2型糖尿病的研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

近年來(lái)，腸道菌群與人類疾病的研究領(lǐng)域逐漸成為熱點(diǎn)，尤其在腸道菌群與2型糖尿病等代謝性疾病的關(guān)系研究。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，多形擬桿菌、氣單胞菌等均與2型糖尿病的發(fā)生存在一定的相關(guān)性[7-8]，但機(jī)制不明。目前，腸道菌群失調(diào)與2型糖尿病發(fā)生的可能機(jī)制研究主要有短鏈脂肪酸學(xué)說(shuō)、膽汁酸學(xué)說(shuō)、內(nèi)毒素學(xué)說(shuō)、生長(zhǎng)因子學(xué)說(shuō)等[9]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多與胰島素抵抗和肥胖等代謝紊亂相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵益生菌株被發(fā)現(xiàn)(如Akk菌)。Akk菌是一種革蘭氏陰性厭氧球菌，2004年，德里安教授和她的團(tuán)隊(duì)將其在人體腸道中分離出來(lái)，命名為Akkermansia muciniphila。Akk菌可以使用人類腸道上皮細(xì)胞覆蓋著的一層黏膜層，作為其能源，因該黏膜層富含黏蛋白。這種黏液層可以作為許多腸道菌群的黏合劑，促進(jìn)人體和微生物相互作用。Akk菌通過(guò)使用這種黏蛋白，與腸道內(nèi)其他菌群產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用從而保護(hù)腸道免受病原體侵害[10]。與其他腸道菌不同的是，Akk菌可以儲(chǔ)備黏蛋白，即使在腸道中沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(特別是在禁食期間)，也可以蓬勃地繁衍生息。除了利用黏蛋白作為能源供給，科學(xué)家們認(rèn)為Akk菌也可能參與恢復(fù)腸道黏蛋白儲(chǔ)備的機(jī)制，達(dá)到自給自足[11]。Akk菌被認(rèn)為是健康人體腸道中最豐富的黏液溶解細(xì)菌。腸道中低水平的Akk菌可能導(dǎo)致黏膜層的變薄，從而導(dǎo)致腸道屏障功能減弱，使腸道內(nèi)的毒素更容易侵入人體?；加醒装Y性腸病、肥胖癥和II型糖尿病的患者體內(nèi)的Akk菌含量會(huì)有所降低[12]。Akk菌在降解黏蛋白的同時(shí)，會(huì)釋放各種副產(chǎn)物，包含乙酸，這是腸道中一種重要的短鏈脂肪酸，可以通過(guò)其厭食效應(yīng)起到控制體質(zhì)量的作用。有證據(jù)表明Akk菌在腸道的數(shù)目和乙酸鹽含量之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性[13]。同時(shí)，Akk菌可以誘導(dǎo)空腹誘導(dǎo)脂肪因子(FIAF)，可降低脂肪儲(chǔ)存能力的表達(dá)。目前的研究表明，給小鼠灌喂活的Akk菌，可以在不影響食欲和飲食習(xí)慣的情況下來(lái)預(yù)防飲食誘導(dǎo)性的肥胖[14]。

本研究通過(guò)對(duì)比IR組和NCD組小鼠腸道內(nèi)Akk菌豐度發(fā)現(xiàn)，IR組小鼠腸道內(nèi)Akk菌豐度顯著低于NCD組，通過(guò)對(duì)比IR組與N-IR組小鼠腸道內(nèi)Akk菌豐度發(fā)現(xiàn)，IR組小鼠腸道內(nèi)Akk菌豐度低于N-IR組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，小鼠胰島素抵抗的發(fā)生可能與小鼠腸道內(nèi)Akk菌的減少相關(guān)。