胡 昕， 齊曼古力·吾守爾， 王 菲， 孫 慧， 江道斌， 文 進， 吳佩環(huán)， 王 晶

(新疆醫(yī)科大學1第一附屬醫(yī)院呼吸與呼吸危重癥中心一病區(qū)， 烏魯木齊 830054； 2第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學二科， 烏魯木齊 830028)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)近年來的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢[1]。在哮喘的治療中，某些傳統(tǒng)藥物療效并不理想，甚至是基因藥物。隨著遺傳學的進展，表觀遺傳學連通了環(huán)境與遺傳這兩大系統(tǒng)，為該病的治療帶來了新的契機，DNA甲基化是它主要調(diào)控機制之一。有研究提示ADAM33基因DNA甲基化程度與哮喘存在一定關聯(lián)性[2-4]。目前，ADAM33基因DNA甲基化水平與新疆成年人哮喘的關聯(lián)性研究鮮有報道。本課題運用亞硫酸氫鹽PCR測序(BSP)技術檢測ADAM33基因CpG島的DNA甲基化程度，初步探索其DNA甲基化水平與新疆成人哮喘的關聯(lián)性，為哮喘的個體化治療提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年11月-2014年12月經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸科住院的、明確診斷哮喘的成人患者10例作為哮喘組，哮喘組均符合中華醫(yī)學會2012年制定的《支氣管哮喘防治指南》，其中，男性5例，女性5例，平均年齡為(45.10±12.02)歲，吸煙人數(shù)7人，F(xiàn)EV1/FVC為(62.88±7.45)%，F(xiàn)EV1/預計值為(98.90±23.98)%。依據(jù)1∶1的配對原則，對照組10例選取了同期、同居住地、性別搭配、年齡相距在5歲以內(nèi)且與哮喘組無血緣關系的健康體檢者，其中，男性5例，女性5例，平均年齡為(45.10±12.14)歲，吸煙人數(shù)4人，F(xiàn)EV1/FVC為(79.29±4.72)%，F(xiàn)EV1/預計值為(103.10±14.68)%。所有病例年齡為15～65歲。經(jīng)過統(tǒng)計分析2組具有可比性。該研究已經(jīng)通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會考核批準(審批號：20131011-06)，且全部受試者均已獲得知情同意。

1.2 主要實驗試劑血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司),KAPA 2G Robust HS PCR Kit with dNTPs(KAPA BIOSYSTEMS),pGM-Simple-T Fast 克隆試劑盒(TIANGEN),EpiTect Bisulfite Kit(QIAGEN),pMD-18-T(TaKaRa)。

1.3 ADAM33基因CpG島上下游引物的信息上游引物序列(5′to 3′)為TTAGGAGTAGAGGTTTTTTGAGAT。下游引物序列(5′to 3′)為CTAACCTACCCCTCAAAAC。產(chǎn)物大小為482 bp。

1.4 DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾處理取外周血提取DNA(1～500 ng) 5 μL 置于200 μL EP管中，加入亞硫酸鹽混合液85 μL、RNase-Free H2O 35 μL、DNA保護溶液15 μL，總體積140 μL。PCR反應條件依次為：95℃ 5 min，60℃ 25 min，95℃ 5 min，60℃ 85 min，95℃ 5 min，60℃ 175 min，12℃保存。并進行純化亞硫酸鹽修飾的DNA。

1.5 甲基化PCR反應PCR反應體系總體積25 μL，具體如下：甲基化修飾的DNA 1 μL、5×KAPA 2G BufferA 5 μL、5×KAPA Enhancer1 5 μL、dNTP Mix(10 mm) 0.5 μL、Primer F(10 uM) 1 μL、Primer R(10 uM) 1 μL、KAPA 2G Robust Hotstart(5 U/μL) 0.1 μL、ddH2O211.4 μL。PCR反應條件依次為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，退火溫度58℃ 30 s，72℃ 60 s，72℃ 7 min，4℃保存，第2～4步循環(huán)39次。

1.6 克隆測序?qū)谆疨CR反應產(chǎn)物進行克隆測序。目的基因與質(zhì)粒載體的連接體系如下：ds cDNA 80 ng、2×Ligation Buffer 5.0 μL、T Vector(50 ng/μL) 0.5 μL、ddH2O 加至10 μL。16℃水浴、連接過夜。經(jīng)過大腸桿菌轉(zhuǎn)化、重組菌的鑒定，陽性菌進行測序(ABI3730)?？寺y序時，發(fā)現(xiàn)反向引物測序的結果較好，因此所有測序用M13反向引物測序，將測序序列反向互補后再進行分析。

1.7 序列對比用BiQ_Analyzer分析軟件對DNA序列和測序序列進行比對。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩樣本計量資料比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DNA甲基化程度分析分析ADAM33基因CpG島I克隆測序和數(shù)據(jù)，測序圖分析結果見圖1、2。哮喘組CpGⅠ甲基化程度為(63.88±9.86)，對照組CpGⅠ甲基化程度為(53.67±5.44)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.010)。在哮喘組和對照組之間比較，ADAM33基因CpG島Ⅰ中19個CpG位點(位點1、3、7、8、14、16、17、19、20、24、25、26、30、31、32、34、35、47、48)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 ADAM33基因CpG島Ⅰ的CPG位點DNA甲基化程度差異分析

注： 與對照組比較，△P<0.05。

圖1 哮喘組ADAM33基因CpG島Ⅰ的DNA甲基化程度分析

圖2 對照組ADAM33基因CpG島Ⅰ的DNA甲基化程度分析

2.2 CpG島Ⅰ DNA甲基化程度與肺功能的相關性CpG島Ⅰ DNA甲基化程度與FEV1/FVC呈負相關，差異具有統(tǒng)計學意義(γ=-0.515，P=0.020)，即甲基化程度越高，F(xiàn)EV1/FVC越低；CpG島Ⅰ DNA甲基化程度與FEV1/預計值呈負相關，差異無統(tǒng)計學意義(γ=-0.181，P=0.446)。

3 討論

作為呼吸系統(tǒng)常見疾病，哮喘涉及各個年齡段的人群，雖然醫(yī)療技術不斷進步，但是哮喘仍然無法治愈，甚至部分患者很快出現(xiàn)了哮喘的并發(fā)癥。近年來，學者們開展了DNA甲基化作用與哮喘的相關研究，并發(fā)現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄過程中，DNA甲基化起了重要的調(diào)控基因組功能的作用[5-6]。

在不同地域中， ADAM33基因與哮喘的相關性研究結果并不完全一致，遺傳背景和環(huán)境暴露因素都可能是不容小覷的影響因素。在ADAM33啟動子中CpG島的作用十分重要，由于ADAM33在上皮細胞出現(xiàn)超甲基化狀態(tài)表達，而在成纖維細胞中則為不表達。Naumova等[2]研究發(fā)現(xiàn)：在17q12-q21位點中，女性兒童DNA甲基化水平明顯高于男性兒童，其哮喘患病率也相應降低；在男性中，成人DNA甲基化水平明顯比兒童高；從而解釋了兒童期中男性哮喘比例明顯高于女性，但在成年后患病率差異縮小。

本課題研究顯示：ADAM33基因CpG島Ⅰ的DNA甲基化水平不完全一致，存在部分CpG位點在2組間的表達有統(tǒng)計學差異，且CpG島Ⅰ的甲基化程度在2組間有統(tǒng)計學差異，哮喘組甲基化程度顯著高于對照組。本研究中比較CPG島DNA甲基化程度與肺功能的相關性，結果顯示，CPG島I DNA甲基化程度與FEV1/FVC呈負相關，差異具有統(tǒng)計學意義，即甲基化程度越高，F(xiàn)EV1/FVC越低，肺功能越差；CpG島Ⅰ的DNA甲基化程度與FEV1/預計值呈負相關，但差異無統(tǒng)計學意義，提示ADAM33基因DNA甲基化水平與哮喘的發(fā)病可能存在一定的關聯(lián)性。與Yang等[3]研究不一致，其研究顯示：所有樣本ADAM33 exon9具有14個高度甲基化CpG位點，病例和對照之間甲基化頻率無顯著差異。此情況考慮可能與研究對象所處的環(huán)境有一定關系，如：生活環(huán)境、飲食環(huán)境、粉塵接觸等。有待于進一步增加樣本量證實該結果，并且進行更加深入的研究，為哮喘的治療提供更多的理論依據(jù)。