巴合提別克·托合塔爾拜克， 李 林， 田亞麗， 古麗海夏·哈勒馬合拜， 張之

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室; 2藥學(xué)院藥理學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011)

近年來糖尿病成為影響人類健康和生存的主要疾病之一[1]。糖尿病是由于胰島素分泌缺陷及(或)其生物學(xué)功能障礙引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。研究表明，高血糖可引起胰島β細(xì)胞損傷[2]，炎癥細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡[3]，長期的高血糖進(jìn)一步刺激炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而產(chǎn)生惡性循環(huán)，高血糖和炎癥在1型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演了重要角色。

鞣花酸是廣泛存在于石榴、藍(lán)莓等植物中的一種天然多酚類物質(zhì)，尿石素A是鞣花酸經(jīng)腸道菌群代謝產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物。研究表明尿石素A(UA)在體內(nèi)外具有抗氧化生物活性[4]，Piwowarski等[5]發(fā)現(xiàn)尿石素A能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，Ryu等[6]研究發(fā)現(xiàn)尿石素A可改善線粒體質(zhì)量和功能，提高衰老肌肉的力量和耐力，是目前為止唯一一個被證實能夠重啟線粒體自噬、逆轉(zhuǎn)肌肉衰老的天然產(chǎn)物。本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病模型小鼠為基礎(chǔ)，研究尿石素A的抗糖尿病作用，并從自噬角度探討其初步作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF級雄性昆明小鼠，8周齡，體質(zhì)量23～25 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心(醫(yī)動字：SCXK2016-0002)，鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，尿石素A(純度≥ 98%，上海甄準(zhǔn)生物有限公司)，氯喹(CQ，武漢鼎暉生物科技有限公司)，普通飼料(新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)。糖化血清蛋白(glycosylated serum protein，GSP)，胰島素(Insulin，INS)，白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒均購自思倍特生物科技有限公司。電子天平(廠家：上海菁海儀器有限公司，型號：YP202N)，分析天平(XS205DU)，離心機(jī)(MULTIFUGE X3R)，酶標(biāo)儀(Multiskan GO 1.01.12)，制冰機(jī)(廠家：常熟市菱科電器有限公司，型號：LK20180069)，組織包埋機(jī)(廠家：武漢漢谷醫(yī)療科技有限公司，型號：HB-P2)，自動脫水機(jī)(LEICA.TP 1020型)，切片機(jī)(LEICA.RM 2235型)，血糖儀(Roche Diagnostic,mannheim,Germany)。

1.2 糖尿病模型制備昆明小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分出正常對照組(C)10只，其余小鼠禁食不禁水12 h后按50 mg/kg的劑量腹腔注射脲佐菌素(STZ)5 d，每天1次，正常對照組腹腔注射同體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后剪尾取血測空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L，且出現(xiàn)多飲多尿癥狀為造模成功。所有小鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，所有動物均按照《中華人民共和國動物保護(hù)公約》的規(guī)定處理。

1.3 動物分組及給藥將STZ腹腔注射造模成功的小鼠根據(jù)空腹血糖隨機(jī)分為模型組(M)、尿石素A干預(yù)組(UA)和尿石素A和自噬抑制劑氯喹干預(yù)組(UA+CQ)，每組10只。實驗期間，正常對照組和模型組根據(jù)體質(zhì)量灌胃生理鹽水，UA組和UA+CQ組每天按50 mg·kg-1·d-1劑量給予尿石素A灌胃，UA+CQ組另外每3天按50 mg/kg的劑量腹腔注射氯喹溶液，連續(xù)給藥8周。藥物劑量50 mg/kg是根據(jù)人類營養(yǎng)和藥物活性成分的標(biāo)準(zhǔn)給藥方案[7]和Savi等[8]的研究結(jié)果來確定。

1.4 空腹血糖和口服葡萄糖耐量的測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)采用ACCU-CHEK血糖儀剪尾取血法測定。在口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)中，小鼠禁食不禁水6 h后稱重，并測空腹血糖，然后按2 g/kg的量予葡萄糖灌胃，在灌胃后的15、30、60、90、120 min檢測血糖水平，計算曲線下面積AUC，AUC=1/4×空腹血糖+1/2×0.5 h血糖值+3/4×1 h血糖值+2 h血糖值。

1.5 血清樣本的收集和指標(biāo)檢測實驗結(jié)束時，所有小鼠禁食不禁水4 h，稱重并測量空腹血糖。用10%水合氯醛麻醉小鼠，確認(rèn)小鼠對疼痛無反應(yīng)后摘除眼球采集血樣，3 000 r/min 4℃離心10 min后收集血清，分裝后存儲在-80℃冰箱中，用于檢測GSP、INS、IL-1β、TNF-α水平。

1.6 胰臟樣本的收集和病理學(xué)觀察取下小塊胰尾用2.5%戊二醛固定，4℃保存，鋨酸固定，脫水，環(huán)氧樹脂包埋后用JEOL1230(H)型透射電鏡觀察。胰頭用4%多聚甲醛固定，乙醇分級脫水后石蠟包埋，5～6 μm石蠟切片后HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。剩余胰臟投入液氮中，最后保存于-80℃冰箱備用。

2 結(jié)果

2.1 尿石素A對糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響正常對照組小鼠體質(zhì)量逐漸升高，糖尿病模型組小鼠體質(zhì)量逐漸下降，第2、4、6、8周明顯低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。在給藥第8周，UA組體質(zhì)量大于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。UA + CQ組小鼠體質(zhì)量呈下降趨勢，在給藥第8周時明顯低于UA組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 尿石素A對糖尿病小鼠空腹血糖的影響糖尿病模型建立后第2、4、6、8周，模型組小鼠空腹血糖顯著高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。給藥2、4、6、8周，UA組空腹血糖均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。在給藥第6、8周，UA+CQ組血糖高于UA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 尿石素A對糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01; 與模型組比較，#P<0.05; 與UA組比較，△P<0.05。

表2 尿石素A對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

注： 與正常對照組比較,**P<0.01; 與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01; 與UA組比較,△P<0.05。

2.3 尿石素A對糖尿病小鼠血清GSP和INS水平的影響與正常對照組比較，糖尿病模型組小鼠GSP和INS升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，UA組GSP和INS顯著降低(P<0.01)。與UA組比較，UA+CQ組GSP和INS水平高于UA組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

2.4 尿石素A對糖尿病小鼠口服糖耐量的影響糖負(fù)荷后30、60、120 min 3個時間點,模型組的血糖值均明顯高于正常對照組(P<0.01)，UA組血糖值均低于模型組，在60、120 min差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。在糖負(fù)荷后30、60、120 min時UA+CQ組血糖值高于UA組，在60 min時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常對照組比較, 模型組口服糖耐量曲線下面積AUC明顯增大(P<0.01)，與模型組比較，UA組曲線下面積降低(P<0.05)，與UA組比較，UA+CQ組口服糖耐量曲線下面積AUC較大，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

2.5 尿石素A對糖尿病小鼠血清炎癥因子IL-1β和TNF-α的影響與正常對照組比較，模型組小鼠血清IL-1β、TNF-α 水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，UA組IL-1β、TNF-α 明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。與UA組比較，UA+CQ組IL-1β、TNF-α均高于UA組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。見表5。

表3 尿石素A對糖尿病小鼠GSP和INS水平的影響

注：與正常對照組比較，**P<0.01; 與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

表4 尿石素A對糖尿病小鼠OGTT的影響

注： 與正常對照組比較，**P<0.01; 與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01; 與UA組比較，△P<0.05。

表5 尿石素A對糖尿病小鼠IL-1β和TNF-α的影響

注： 與正常對照組比較，**P<0.01; 與模型組比較，##P<0.01; 與UA組比較，△△P<0.01。

2.6 尿石素A對1型糖尿病小鼠胰島形態(tài)的影響正常對照組小鼠胰島細(xì)胞形態(tài)正常，大小均勻，胰島數(shù)量及島內(nèi)細(xì)胞數(shù)均較多，胞漿充實飽滿；模型組小鼠胰島明顯萎縮，形狀雜亂，邊界模糊，細(xì)胞數(shù)相對減少，胞漿疏松；UA組小鼠胰島尚小，但是形狀已基本規(guī)則，胰島與外分泌部界限比較清晰，胰島細(xì)胞數(shù)目比模型組增多。UA+CQ組小鼠胰島萎縮，邊界模糊，胰島數(shù)目較少，比模型組稍好。見圖1。

A：正常對照組

B：模型組

C：尿石素A干預(yù)組

D：尿石素A和自噬抑制劑氯喹干預(yù)組

圖1 尿石素A對1型糖尿病小鼠胰島形態(tài)的影響(HE染色，×200，箭頭示胰島)

2.7 尿石素A對1型糖尿病小鼠胰腺組織超微結(jié)構(gòu)和自噬小體的影響透射電鏡下糖尿病模型組胰島細(xì)胞數(shù)量少，分泌顆粒少，線粒體腫脹多，線粒體嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，髓鞘樣小體形成。與糖尿病模型組小鼠比較，UA組小鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)損傷較少。UA+CQ組胰腺細(xì)胞線粒體腫脹、雙層膜結(jié)構(gòu)不清，線粒體嵴斷裂等變化與糖尿病模型組幾乎相同。UA組小鼠的胰島細(xì)胞中觀察到大量的自噬空泡，而在糖尿病模型組和UA+CQ組小鼠的細(xì)胞中觀察到更多包含未降解物的自噬泡。見圖2。

M組

UA組

UA+CQ組

圖2 尿石素A對1型糖尿病小鼠胰腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和自噬小體的影響

(TEM, 6 000×80 KV, scale bar, 2 μm，紅色方框表示含有細(xì)胞碎片的自噬液泡及其部分放大結(jié)果)

3 討論

本研究以小劑量多次腹腔注射STZ建立1型糖尿病小鼠模型，隨著病程的進(jìn)展糖尿病小鼠出現(xiàn)精神萎靡，多飲多食多尿，體質(zhì)量下降等類似人類糖尿病的癥狀，而尿石素A干預(yù)后糖尿病小鼠以上癥狀顯著改善，小鼠狀態(tài)明顯活躍、毛發(fā)光亮，墊料潮濕度明顯降低。

高血糖和炎癥在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色[9]，高血糖和炎癥都可以損傷胰島β細(xì)胞，促進(jìn)胰島細(xì)胞凋亡，最終可導(dǎo)致胰腺胰島素分泌耗竭。近年來，大量臨床證據(jù)證實他汀類藥物[10]、PPAR激動劑[11]和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑[12]因具有一定的抗炎作用，可能有一定的預(yù)防或延緩糖尿病的作用，但這些西藥的不良反應(yīng)多。本研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物尿石素A能夠顯著降低糖尿病小鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α和 IL-1β水平，具有顯著改善糖尿病炎癥狀態(tài)的作用。高血糖引起白蛋白和其他蛋白分子N未端發(fā)生非酶促糖化反應(yīng)，形成糖化血清蛋白，白蛋白半壽期為17～20日，因此糖化血清蛋白是反映近期2～3周內(nèi)血糖控制水平的一個靈敏指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示糖尿病小鼠空腹血糖、糖化血清蛋白顯著升高，并伴有高胰島素血癥，但是給予糖負(fù)荷后小鼠血糖不能有效降低，揭示該糖尿病模型小鼠胰島β細(xì)胞在高血糖刺激時尚能代償性分泌大量胰島素，但胰島素不能正常地發(fā)揮作用，不能有效地促進(jìn)外周胰島素靶器官攝取葡萄糖來降低血糖，說明該糖尿病模型小鼠分泌的胰島素質(zhì)量或敏感性下降，提示有胰島素抵抗，Kaul等[13]也報道1型糖尿病模型有胰島素抵抗現(xiàn)象。尿石素A干預(yù)之后糖尿病小鼠空腹血糖、糖化血清蛋白及糖負(fù)荷后血糖水平均顯著降低，同時胰島素水平也降低，因此尿石素A可能并不是通過提高胰島素分泌量來降血糖的，尿石素A可能改善了胰臟分泌的胰島素的質(zhì)量或敏感性[14]。

細(xì)胞自噬是機(jī)體生成自噬小體包裹錯誤折疊的蛋白質(zhì)、功能失調(diào)的細(xì)胞器等有害物質(zhì)，通過溶酶體與自噬體融合，降解清除細(xì)胞自身病變物質(zhì)使細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)的過程，在保證細(xì)胞質(zhì)量方面有重要作用。Hirotaka等[15]報道自噬活動的抑制會導(dǎo)致糖尿病胰腺β細(xì)胞凋亡或功能障礙，Zhao等[16]報道自噬激活可改善膿毒癥患者的肺損傷和炎癥，而抑制自噬會加重炎癥，已有研究報道正常的自噬活動提高胰島素分泌質(zhì)量和胰島素敏感性[17-18]。因此自噬過程與胰島β細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、胰島素分泌質(zhì)量及炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。尿石素A對糖尿病小鼠具有顯著的降糖、改善炎癥狀態(tài)、改善胰島和β細(xì)胞病理形態(tài)等作用，但與氯喹聯(lián)合用藥后，尿石素A的上述作用被嚴(yán)重削弱。氯喹是一種自噬抑制劑，可抑制自噬體與溶酶體的融合過程從而抑制自噬性清除，本研究中尿石素A干預(yù)小鼠的胰島細(xì)胞中觀察到大量的自噬空泡，而聯(lián)合氯喹干預(yù)后觀察到更多包含未降解物的自噬泡，因此尿石素A可能是通過激活自噬促進(jìn)異?；蚬δ苷系K細(xì)胞器及時被降解清除，從而恢復(fù)胰腺β細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，改善了胰島素分泌質(zhì)量，從而糾正了糖尿病高糖、高炎癥狀態(tài)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸前體物鞣質(zhì)具有抗糖尿病作用[19]，但鞣質(zhì)從腸道難吸收，因此推測富含鞣花鞣質(zhì)的果蔬抗糖尿病的作用可能與其腸道菌代謝產(chǎn)物尿石素A的降糖、抗炎作用有關(guān)。本研究結(jié)果為富含鞣花酸的果蔬及一些中藥如石榴等的抗糖尿病作用提供了一定的藥理學(xué)依據(jù)，自噬信號途徑在尿石素A保護(hù)胰腺β細(xì)胞作用中的詳細(xì)分子機(jī)制值得進(jìn)一步探索。