湯玉嬌 戴詩巖 周羽婷 程圭芳 何品剛 方禹之

摘?要?構(gòu)建了一種利用DNA模板點擊化學和催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)（Catalyzed hairpin assembly，CHA）指示并放大信號，檢測miRNA-21的新型均相電化學生物傳感器。根據(jù)目標物miRNA-2的序列設(shè)計了兩種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針，分別修飾5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）和3（2-呋喃）丙酸（FPA），利用目標物miRNA-2引發(fā)的兩種探針間的催化發(fā)夾組裝使ADNQ和FPA的分子間距縮小，發(fā)生Diels-Alder反應(yīng)，在實現(xiàn)目標物循環(huán)信號放大的同時，破壞ADNQ的化學結(jié)構(gòu)，導致電化學響應(yīng)信號降低，據(jù)此檢測miRNA-21的濃度。采用循環(huán)伏安法（CV）、差分脈沖伏安法（DPV）和凝膠電泳等考察了此傳感器的分析性能。結(jié)果表明，在0.1～1.0×104 pmol/L濃度范圍內(nèi)，此傳感器響應(yīng)電流變化值與miRNA-21濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，檢出限為0.037 pmol/L（S/N=3）。將此傳感器用于小鼠血清和全血裂解液樣品的檢測，結(jié)果表明， 本傳感器適用于miRNA-21的檢測。

關(guān)鍵詞?DNA模板點擊化學; Diels-Alder反應(yīng); 催化發(fā)夾組裝; 電化學生物傳感器

1?引 言

miRNAs是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼RNA，在多種腫瘤中表達水平高于正常水平，可作為代表性的腫瘤生物標記物，如miRNA-21在乳腺癌細胞和上皮卵巢癌細胞中的表達水平顯著高于正常水平[1～3]。因此，建立快速有效的miRNA分析檢測方法對腫瘤的診斷和預后有重要意義。

目前，檢測miRNA的方法主要有Northern blotting法[4]、實時熒光定量PCR法[5]、原位雜交法[6]和微陣列芯片法[7]等。這些方法各有自身的優(yōu)點，如實時熒光定量PCR法檢測速度快、靈敏度高。然而，這些方法通常需要昂貴的試劑，對設(shè)備和操作人員要求較高[8]。相比之下，電化學生物傳感器成本低、靈敏度高、特異性好、操作簡單、易于小型化，具有明顯的實際應(yīng)用優(yōu)勢[9，10]。

點擊化學反應(yīng)是一類反應(yīng)條件溫和的反應(yīng)[11，12]，已被用于構(gòu)建傳感器[13～15]。5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）具有良好的電化學活性，可與3（2-呋喃）丙酸（FPA）發(fā)生點擊化學反應(yīng)，導致其電化學活性降低。利用此特性，本研究構(gòu)建了一種基于DNA模板點擊化學和催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)[16～18]的新型均相電化學DNA生物傳感器，用于miRNA-21的檢測，檢測原理如圖1所示。當不存在目標物miRNA-21時，Probe-ADNQ和Probe-FPA不發(fā)生相互作用，分別修飾在Probe 1和Probe 2上的ADNQ和FPC距離較遠，不能發(fā)生點擊化學反應(yīng)，因此Probe-ADNQ能在工作電極上產(chǎn)生一個良好的ADNQ的DPV特征信號。當存在miRNA-21時，miRNA-21通過堿基互補配對將Probe-ADNQ的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，使Probe-ADNQ莖部的堿基序列暴露出來，然后通過堿基互補配對將Probe-FPA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，并將miRNA-21替換下來，使其進入下一個催化循環(huán);在目標物miRNA-21的作用下，Probe-ADNQ和Probe-FPA通過堿基互補配對形成DNA雙鏈，分別修飾在Probe 1和Probe 2上的ADNQ和FPC的距離被拉近，發(fā)生點擊化學反應(yīng)，ADNQ的分子結(jié)構(gòu)被破壞，其在工作電極上產(chǎn)生的ADNQ的DPV特征信號降低信號降低值與miRNA-21在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。 基于此可實現(xiàn)miRNA-21的定量檢測。將本方法用于小鼠血液樣品中miRNA-21的檢測，結(jié)果表明， 本方法實用性良好。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

CHI660電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）。石墨烯、5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）、3（2-呋喃）丙酸（FPA）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、琥珀酸（SA）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購自上海源葉生物科技有限公司。其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水（電阻率>18 MΩ cm，由上海純浦實業(yè)有限公司超純水儀制備）。所用緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl， 15 mmol/L KCl， 4 mmol/L MgCl2， pH=7.4）和Na2CO3-NaHCO3緩沖液（0.05 mol/L， pH=8.9）。寡聚核苷酸均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表1。

2.2?實驗方法

2.2.1?Probe-ADNQ和Probe-FPA的合成?取0.28 g SA、1.36 g EDC·HCl、0.66 g NHS和10 mL DCM置于25 mL圓底燒瓶，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，將DCM蒸干，用水洗滌產(chǎn)物，55℃烘干，得到N，N'-（丁二酰二氧基）二琥珀酰亞胺（DSS）固體。將18 nmol Probe1、4 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH=8.9）、0.05 g DSS和4 mL二甲基亞砜（DMSO）在25 mL圓底燒瓶中混合，室溫下攪拌反應(yīng)4 h，用截留分子量為3000的超濾管超濾純化。在純化產(chǎn)物中加入4 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH=8.9）、4 mL DMSO和0.06 g ADNQ，在25 mL圓底燒瓶中混合，室溫下攪拌反應(yīng)4 h。超濾純化，所得的Probe-ADNQ溶于PBS（pH=7.4）， 4℃保存。

取0.5 g FPA、 1.71 g EDC·HCl、 1.03 g NHS、 10 mL DCM和0.5 mL二異丙基乙胺，在25 mL圓底燒瓶中混合，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，用水洗滌，有機相用無水Na2SO4干燥后，將DCM蒸干，保留固體。將18 nmol Probe 2、 0.155 g固體產(chǎn)物、4 mL DMSO和4 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH=8.9）在25 mL圓底燒瓶中混合，室溫下攪拌反應(yīng)4 h，超濾純化，所得Probe-FPA溶于PBS（pH 7.4），4℃保存。

2.2.2?石墨烯納米金復合材料的合成?將1 mg石墨烯和0.1 g抗壞血酸充分分散到10 mL水中，加入2 mL 1%（w/w）氯金酸溶液，室溫下攪拌反應(yīng)8 h，離心，產(chǎn)物分散到1 mL水中。

2.3?電化學檢測

用0.05 μm氧化鋁粉拋光打磨玻碳電極（d=3 mm）， 用氮氣吹干，在電極表面滴涂5 μL石墨烯納米金復合材料，50℃下烘干。

Probe-ADNQ和Probe-FPA溶液濃度均為2 μmol/L，與不同濃度的miRNA-21在Tris-HCl緩沖液（pH=7.4）中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)液滴涂到石墨烯納米金修飾電極的表面，50℃下烘干，于PBS溶液（pH 7.4）中用差分脈沖伏安法（DPV）采集電化學信號。三電極體系：修飾玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極和Pt絲電極為參比電極和對電極，掃描范圍為0.60～0.15 V，掃描速度為0.1 V/s。

3?結(jié)果與討論

3.1?傳感器的可行性實驗

考察了利用點擊化學指示電化學傳感器信號的可行性。如圖2A所示，濃度較高時，ADNQ有很強電化學響應(yīng)， FPA沒有明顯的電化學信號，ADNQ和FPA在室溫下反應(yīng)1 h后， 電化學響應(yīng)明顯降低，說明濃度較高時，ADNQ和FPA間發(fā)生點擊化學反應(yīng)的機率大，ADNQ的化學結(jié)構(gòu)被破壞，失去電化學活性。如圖2B所示，濃度較低時，ADNQ有較強的電化學響應(yīng)信號，F(xiàn)PA沒有明顯的響應(yīng)信號，低濃度的ADNQ和FPA在室溫下反應(yīng)1 h后，其電化學響應(yīng)信號無明顯變化，說明濃度較低時ADNQ和FPA間發(fā)生點擊化學反應(yīng)的機率很低，ADNQ的化學結(jié)構(gòu)不易被破壞，電化學響應(yīng)信號無明顯降低。上述結(jié)果表明，可利用ADNQ和FPA間的點擊化學反應(yīng)指示電化學傳感器的響應(yīng)信號。

考察了采用ADNQ和FPA修飾探針指示傳感器信號的可行性。如圖3所示，Probe-ADNQ有較強電化學信號（圖3曲線a），Probe-FPA無明顯電信號（圖3曲線b）。當不存在目標物miRNA-21時，Probe-ADNQ和Probe-FPA的反應(yīng)混合物有較強的電化學信號（圖3曲線c），說明Probe-ADNQ和Probe-FPA間不能形成雙鏈，修飾在探針上的ADNQ和FPA距離遠，不能發(fā)生點擊化學反應(yīng)。當存在目標物miRNA-21時，Probe-ADNQ和Probe-FPA的反應(yīng)混合物電化學信號顯著下降（圖3曲線d）， 說明Probe-ADNQ和Probe-FPA間形成雙鏈，修飾在探針上的ADNQ和FPA距離被拉近，發(fā)生點擊化學反應(yīng)。上述結(jié)果表明，可通過目標物miRNA引發(fā)Probe-ADNQ和Probe-FPA形成雙鏈，使修飾在探針上的ADNQ和FPA發(fā)生點擊化學反應(yīng)，指示電化學傳感器的響應(yīng)信號。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法考察目標物是否能引發(fā)Probe 1 和Probe 2形成雙鏈。如圖4所示，不存在目標物miRNA-21時，泳道e只有兩個條帶，且分別與泳道b和泳道c中Probe 1 和Probe 2的位置對應(yīng)，Probe 1與Probe 2未形成雙鏈;目標物miRNA-21存在時，泳道d中出現(xiàn)了一個新的條帶，且分別與Probe 1和Probe 2對應(yīng)的兩個條帶明亮度變暗，表明Probe 1和Probe 2形成雙鏈。電泳實驗結(jié)果表明，目標物miRNA-21可引發(fā)Probe 1和Probe 2形成雙鏈。

3.2?實驗條件的優(yōu)化

探針濃度、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度對傳感器的檢測性能有重要影響。當探針濃度過低時，miRNA-21引發(fā)Probe-ADNQ和Probe-FPA形成雙鏈的效率低，不利于檢測。如圖5A所示，隨著探針濃度增加，傳感器響應(yīng)電流ΔI增大，當探針濃度為2.0 μmol/L時，傳感器ΔI趨于穩(wěn)定。因此，選擇最適探針濃度為2.0 μmol/L。如圖5B所示，隨著反應(yīng)時間延長，傳感器ΔI先增加，50 min后達到穩(wěn)定。選擇50 min為最佳反應(yīng)時間。反應(yīng)溫度過低時，反應(yīng)速率低;反應(yīng)溫度過高，不利于DNA鏈之間的雜交。如圖5C所示，隨著反應(yīng)溫度升高，傳感器ΔI先增加， 30℃時ΔI開始下降。因此，選擇最佳反應(yīng)溫度為30℃。

3.3?傳感器的特異性

用本傳感器分別檢測0.1 nmol/L的miRNA-21、單堿基錯配miRNA、三堿基錯配miRNA、完全不互補miRNA的響應(yīng)信號。如圖6所示，單堿基錯配miRNA、三堿基錯配miRNA和完全不互補miRNA的檢測信號都很弱，分別為miRNA-21檢測信號的12.8%、 7.1%和6.9%，說明傳感器具有良好的特異性。

3.4?傳感器的分析性能

在最佳實驗條件下，對不同濃度的miRNA-21進行了檢測。以2.0 μmol/L Probe-ADNQ的信號為起始信號， 以2.0 μmol/L Probe-ADNQ、 2.0 μmol/L Probe-FPA和miRNA-21反應(yīng)后的信號作為結(jié)束信號，以起始信號與結(jié)束信號之差ΔI作為傳感器輸出信號。如圖7A所示，隨著miRNA-21濃度增加（0、 0.1、 1、 10、 100、 500、 1000、 5000和10000 pmol/L），傳感器DPV峰電流逐漸減小，說明miRNA-21引發(fā)probe-ADNQ和Probe-FPA形成雙鏈的效率增加，分別標記在探針上的ADNQ與FPA發(fā)生點擊化學反應(yīng)的效率增加，ADNQ的化學結(jié)構(gòu)被破壞，其特征電信號下降。如圖7B所示，當miRNA-21濃度在0.1～1.0×104 pmol/L范圍內(nèi)時，ΔI隨miRNA-21濃度對數(shù)值的增加而線性增大，其線性回歸方程ΔI（μA）=0.31+0.08lgCmiRNA-21 （pmol/L）， R2=0.9793，檢出限為0.037 pmol/L（S/N=3）。

3.5?實際小鼠血樣分析

采用傳感器對小鼠全血和血清樣品中的miRNA-21進行了測定，考察傳感器的實用性， 小鼠全血和血清中未檢出miRNA-21，標準添加實驗結(jié)果如表2和表3所示。結(jié)果表明，小鼠血清中的加標回收率為92.0%～105.0%，RSD小于5.5%;全血裂解液中的加標回收率為96.0%～104.0%，RSD小于7.0%，表明本傳感器實用性良好，可用于實際樣品的檢測。

4?結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于DNA模板點擊化學和催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)的新型均相電化學生物傳感器，用于miRNA-21的檢測。傳感器不需要將探針固定在電極表面，制備簡單快速;其與目標物的識別與檢測發(fā)生在溶液中，位阻小，識別效率高;使用催化發(fā)夾組裝放大信號，不使用酶;此傳感器利用miRNA-21引發(fā)分別標記在探針上的ADNQ和FPA間的點擊化學反應(yīng)指示傳感器信號，僅需5 μL反應(yīng)液即可獲得可觀的信號響應(yīng)。此傳感器操作簡單、靈敏度高、特異性好，具有良好的實際應(yīng)用價值。

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