龍朝陽，蔣桂江，鐘麗雁，梁艷，李鳳珍，李妮，王苑儷，李新明

(廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一類以關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病。臨床主要表現(xiàn)為對稱性、多關(guān)節(jié)性、慢性炎癥病變，可累及多個系統(tǒng)。其具體發(fā)病原因和機(jī)制至今仍未完全明了，可能與遺傳基因等相關(guān)[1-2]。關(guān)節(jié)滑膜炎為其基本病變之一[3]。血管新生是RA慢性增生性滑膜炎和血管翳形成不可或缺的一部分，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為血管新生的重要誘導(dǎo)劑，起著關(guān)鍵作用。本研究選擇膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritic，CIA)大鼠模型，探討清毒伸筋湯對大鼠血清VEGF的影響，揭示其阻止RA骨破壞的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 動物 清潔級、雌性 Wistar大鼠，體重(200±30)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物許可證號：SCXK 20160005)。

1.2 試劑 弗氏不完全佐劑(Sigma公司，批號：SLBS1330V)，牛Ⅱ型膠原蛋白(北京Solarbio公司，批號：1122D056)，VEGF試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號25413441111)。

1.3 藥物 甲氨蝶呤(MTX，上海信宜藥廠有限公司，批號：1807703)，清毒伸筋湯(組成：腫節(jié)風(fēng)20 g，忍冬藤20 g，救必應(yīng)20 g，青風(fēng)藤15 g，兩面針15 g，雞血藤15 g，伸筋草15 g)，免煎顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1706070、1706082、1707118、1706024、1708101、1708175、1707035)。

1.4 造模方法 按文獻(xiàn)記載方法[4]，在無菌條件下，取濃度4 mg/L牛Ⅱ型膠原蛋白溶液與濃度為1 g/L弗氏不完全佐劑等體積反復(fù)混合，充分乳化至“油滴水狀”。造模時每只大鼠背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射上述混合乳液共0.25 ml，需于初次、第14 d共2次注射混合乳液致炎。造模成功的判斷方法：采用Wood氏的關(guān)節(jié)炎評估標(biāo)準(zhǔn)評價各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)，具體內(nèi)容如下：每只足爪損害分為0～4級，計分對應(yīng)0～4分，計算4個足爪的總分。正常為0分;1個指關(guān)節(jié)紅腫為1分;2個及以上指關(guān)節(jié)或整個足爪輕度紅腫為2分;足爪紅腫較重為3分;足爪重度紅腫，缺乏彈性為4分。積分大于或等于4分即認(rèn)為造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 60只大鼠，隨機(jī)選出10只為正常組，其余大鼠造模，選取50只造模成功大鼠，隨機(jī)分為5組(模型組、清毒伸筋湯高劑量組、清毒伸筋湯中劑量組、清毒伸筋湯低劑量組、甲氨蝶呤組)，每組10只。

1.6 治療方法 灌胃給藥。動物用藥量換算參照文獻(xiàn)[5]，按“mg/kg折算mg/m2轉(zhuǎn)換因子”計算法，具體公式：大鼠用藥量=(大鼠轉(zhuǎn)換因子÷人轉(zhuǎn)換因子)×人用藥量。正常組、模型組自由飲水;清毒伸筋湯高、中、低劑量組，分別以相當(dāng)于2倍臨床常用量(41.14 mg生藥/kg大鼠)、1倍臨床常用量(20.57 mg生藥/kg大鼠)、0.5倍臨床常用量(10.29 mg生藥/kg大鼠)的消毒伸筋湯免煎顆粒配成藥液，每日分2次灌胃;甲氨蝶呤組以相當(dāng)于1倍臨床常用量(9.20 mg/kg)配成藥液，每周1次灌胃。連續(xù)治療4周。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分 采用Wood氏的關(guān)節(jié)炎評估標(biāo)準(zhǔn)評價各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

1.7.2 VEGF檢測 治療結(jié)束后，各組大鼠取血，分離血清。采用ELISA法檢測VEGF含量，具體方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

甲氨蝶呤組AI與VEGF含量均較模型組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。清毒伸筋湯中、高劑量組AI改善情況、VEGF含量變化優(yōu)于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明清毒伸筋湯能減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫痛癥狀，抑制其體內(nèi)VEGF表達(dá)，從而改善病情。清毒伸筋湯低劑量組與模型組比較，AI與VEGF含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，表明清毒伸筋湯不同劑量對療效有影響，臨床常用劑量可起到治療效果。見表1。

表1 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分及血清中VEGF含量 ±s，n=10)

表1 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分及血清中VEGF含量 ±s，n=10)

注：與模型組比較，a：t=2.117，P=0.048;b：t=4.529，P＜0.001;c：t=3.638，P=0.002;d：t=1.023，P=0.320;e：t=21.912，P＜0.001;f：t=25.249，P＜0.001;g：t=16.462，P＜0.001;h：t=1.810，P=0.087

組別 劑量(mg/kg) AI VEGF(μg/L)正常組32.47±4.06模型組 - 12.50±1.72 142.84±7.04甲氨蝶呤組 9.20 10.90±1.66a 83.36±4.91e清毒伸筋湯高劑量組 41.14 9.60±1.07b 69.30±5.94f清毒伸筋湯中劑量組 20.57 10.00±1.33c 90.23±7.25g清毒伸筋湯低劑量組 10.29 11.80±1.32d 136.29±9.01-0 h

3 討論

RA壯醫(yī)病名為滾克，緣于患者身體虛弱，風(fēng)毒、寒毒、濕毒、熱毒乘虛而入，阻滯龍路、火路及氣道、谷道、水道，使天地人三氣不能同步而致病，在治療上以清熱毒、祛風(fēng)毒、除濕毒，通龍路、火路氣機(jī)為主[6]。清毒伸筋湯是廣西名中醫(yī)李鳳珍主任醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方，由腫節(jié)風(fēng)、忍冬藤、救必應(yīng)、青風(fēng)藤、兩面針、雞血藤、伸筋草組成，具有清熱毒、祛風(fēng)毒、除濕毒、疏通龍路和火路氣機(jī)作用，長期臨床應(yīng)用治療RA急性期收到良好的治療效果，無明顯毒副作用，前期研究表明清毒伸筋湯能降低CIA大鼠血清中腫瘤壞死因子-α、白介素-1β水平，抑制炎癥反應(yīng)[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明方中主要藥物具有抗炎、止痛等作用。如：腫節(jié)風(fēng)的有消炎作用，在抗腫瘤治療中對化療藥環(huán)膦酰胺有增效、減毒作用[7]。救必應(yīng)有一定的鎮(zhèn)痛作用[8]。青風(fēng)藤主要含有青藤堿，青藤堿在RA治療中具有免疫抑制、抗炎鎮(zhèn)痛、抑制滑膜血管新生、抑制細(xì)胞增殖和凋亡、抑制骨破壞的作用[9-11]。石宇紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿能下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)及 VEGF、金屬蛋白酶-9水平，抑制滑膜新生血管生成，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥癥狀。兩面針有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，還有一定的保肝作用，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與抑制中樞的前列腺素2、一氧化氮、丙二醛的釋放，提高其抗氧化能力有關(guān)[13-14]。雞血藤有雙向調(diào)節(jié)免疫功能、鎮(zhèn)痛、保護(hù)肝損傷等作用[15-16]。伸筋草生物堿有一定的抗炎作用，能降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清腫瘤壞死因子-α、白介素-1β水平，改善關(guān)節(jié)滑膜病變[17]。

新生血管在RA中起著不可或缺的作用[18]，而VEGF又在血管新生中發(fā)揮重要作用。VEGF可直接促進(jìn)滑膜血管翳形成、加重滑膜炎癥及骨與關(guān)節(jié)軟骨的破壞。新生的血管為增殖的滑膜細(xì)胞供氧和提供營養(yǎng)物質(zhì)，在炎癥的持續(xù)過程中起重要作用[19]。研究表明VEGF及其特異性受體在關(guān)節(jié)炎形成早期開始就起著重要作用，影響著血管新生及病程進(jìn)展，與病情嚴(yán)重程度相關(guān)[20-23]。

本研究顯示經(jīng)治療后，各給藥組AI與VEGF含量均模型組低。其中，與模型組比較，清毒伸筋湯中、高劑量組AI明顯降低、VEGF含量明顯下降。由此，推測清毒伸筋湯能抑制VEGF的表達(dá)，從而抑制滑膜炎新生血管的形成，減輕關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞。研究從細(xì)胞分子角度為清毒伸筋湯臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。