王禹程 馬海樂 楊 雪 黃姍芬 崔鵬飛 李云亮

（江蘇大學食品與生物工程學院 江蘇鎮(zhèn)江212013）

高血壓是常見慢性病之一，是一種以動脈血壓持續(xù)升高為特征的心血管綜合癥，它是我國心腦血管病發(fā)病最主要的危險因素之一，控制高血壓是預防心腦血管疾病的關(guān)鍵措施[1-3]。中國約有2.66 億高血壓患者，超過全球高血壓總?cè)藬?shù)的五分之一，每年因心血管疾病死亡350 萬人，占到死亡總數(shù)的41%[4-5]。目前治療高血壓主要通過藥物治療，常用的藥物包括卡托普利、硝普鈉[6-7]等，由于長期服用此類合成藥物會產(chǎn)生暈眩、惡心、口干、腹痛等副作用，因此，利用天然食物制備安全無毒副作用的降血壓產(chǎn)品成為食品研究領(lǐng)域的熱點之一[8-9]。

菜籽餅粕是油菜榨油后的副產(chǎn)物，其中蛋白含量高達35%～42%，菜籽蛋白沒有限制性氨基酸，生物效價和利用率都很高，然而菜籽中含有毒物質(zhì)硫甙，導致菜籽蛋白一直得不到有效利用，隨著脫毒技術(shù)的提高，脫毒菜籽蛋白中的硫甙含量大幅下降，可以達到安全使用范圍。菜籽蛋白經(jīng)酶解制備的菜籽多肽具有良好ACE 抑制功效[10-11]，而體外試驗中菜籽多肽樣品沒有經(jīng)過人體胃腸消化系統(tǒng)，其結(jié)果不能完全代表體內(nèi)降壓功效[12-13]，有必要進行系統(tǒng)的動物實驗并探究作用機理。本文通過一次性灌胃和30 d 灌胃脫毒菜籽多肽試驗，研究其對高血壓模型鼠的降壓功效、作用器官及其降壓機理，為脫毒菜籽多肽降壓產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

1.1.1 試驗材料 菜籽粕（蛋白含量37%），丹陽市正大油脂有限公司；卡托普利（Captopril，Cap）、N-[3-（2-呋喃基） 丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG），美國Sigma 公司；復合蛋白酶，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；科研試劑盒，南京建成順浩生物科技有限公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.1.2 試驗設備 ALC-NIBP 無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)，上海奧爾科特生物科技有限公司；多功能酶標儀Tecan Infinite PRO TWIN 200，上海迪奧生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫毒菜籽蛋白的提取 參考劉大川等[14]的方法制備脫毒菜籽蛋白，經(jīng)冷凍干燥獲得脫毒菜籽蛋白粉末。

1.2.2 脫毒菜籽多肽的制備 取脫毒菜籽蛋白粉末，使用固體復合蛋白酶，在固液比1∶20（g/mL）、酶底比1∶20 （g/g）、pH 7.5、50 ℃的條件下酶解2 h。于80 ℃熱水浴中滅酶15 min，離心取上清液濃縮后，冷凍干燥得脫毒菜籽多肽粉末（蛋白含量70.3%）。

1.2.3 動物飼養(yǎng) ICR 健康雄性小鼠體質(zhì)量（20±2）g，許可證編號：SCXK（蘇）2013-0011，動物試驗室許可證編號：SYXK（蘇）2013-0036，江蘇大學提供。10 周齡雄性原發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rats，SHR），體質(zhì)量為（280±20） g，許可證編號：SCXK（滬）2012-0002，合格證編號：2015000527221，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。動物均于江蘇大學實驗動物中心屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，溫度保持（24±2） ℃，濕度保持50%±2%，晝夜各半。

1.2.4 毒理學試驗 最大耐受劑量法：40 只ICR小鼠分兩組，每組20 只，兩組分別按總劑量25 g/kg bw 灌胃脫毒菜籽多肽和脫毒菜籽蛋白，分3次進行，每次間隔6 h 以上。連續(xù)觀察10 d，觀察兩組小鼠中毒癥狀及死亡情況。

1.2.5 大鼠分組和給藥劑量 適應性喂養(yǎng)一周，挑選收縮壓大于180 mmHg 的大鼠隨機分4 組，分別為陰性對照組卡托普利組（Cap，劑量30 mg/kg bw·d）、脫毒菜籽多肽組（Rpep，劑量2.5 g/kg bw·d）、脫毒菜籽蛋白組（Rpro，劑量2.5 g/kg bw·d）和對照組（Control，等體積水），每組12 只，一次性和30 d 灌胃實驗各用6 只。

1.2.6 大鼠血壓測定 按劑量一次性灌胃各組對應受試物后使用ALC-NIBP 無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)測定SHR 從灌胃0 h 到24 h 的收縮壓（Systolic blood pressure，SBP） 和舒張壓 （Diastolic blood pressure，DBP）。30 d 灌胃實驗開始后每7 d 測量一次大鼠SBP 和DBP，測定時間為當日灌胃之前。

1.2.7 組織ACE 提取 組織ACE 的提取參考李云亮[15]的方法，略作修改。一次性灌胃實驗在SHR大鼠灌胃6 h 后，30 d 灌胃實驗在最后一次灌胃次日提取組織ACE。每只大鼠腹腔注射15%水合氯醛溶液1 mL 麻醉，通過下腔靜脈放血法收集血液。分離主動脈、肺、心臟和腎臟組織，稱重并計算臟器指數(shù) （臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。剪碎這些組織并加入預冷緩沖溶液 （50 mmol/L Tris-HCl，0.3 mol/L NaCl，0.5%Triton X-100，pH 7.9）（主動脈加液量為20 mL/g，肺和腎臟為4 mL/g，心臟為6 mL/g）進行均質(zhì)，經(jīng)離心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）取上清，即得能溶于表面活性劑Triton X-100 的ACE 部分。

1.2.8 ACE 酶活測定 參考李云亮[15]的方法，F(xiàn)APGG 作為ACE 的底物（血管緊張素I）模擬物，在340 nm 波長處有最大吸收峰，經(jīng)ACE 水解后變成FAP 和GG，使得產(chǎn)物在340 nm 波長下吸光度下降，通過吸光度下降值可以計算出ACE 酶活性，樣品加樣體積和順序見表1。

表1 ACE 酶活測定Table 1 Determination of ACE enzyme activity

酶活定義：37 ℃下，30 min 內(nèi)催化水解1 μmol 底物FAPGG 所需ACE 酶量為1 U。1.2.9 血清指標測定 負壓真空采血管從大鼠腹腔靜脈取血，室溫靜置1 h 自然凝固，平衡后離心（3 000 r/min，10 min，4 ℃），黃色透明上清即為血清。用試劑盒測定血清中腫瘤壞死因子-α（TNFα）、內(nèi)皮素（ET-1）、腎素（Renin）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（eNOS）、血管緊張素II（ANG II）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH-1）和谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶（GST）含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

試驗結(jié)果以SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，試驗數(shù)據(jù)用±s 表示，采用Independent-samples T-test 檢驗，差異顯著水平為P<0.05，差異極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒理學試驗

兩組小鼠按總劑量25 g/kg bw 分別灌胃脫毒菜籽蛋白和脫毒菜籽多肽。10 d 后，兩組40 只小鼠沒有死亡，均能自由活動，沒有任何中毒癥狀出現(xiàn)。說明所制脫毒菜籽蛋白按總劑量25 g/kg bw灌胃對小鼠沒有毒性，經(jīng)復合蛋白酶酶解制備的脫毒菜籽多肽按總劑量25 g/kg bw 灌胃對小鼠同樣沒有毒性，兩種樣品最大耐受劑量均大于25 g/kg bw。

2.2 血壓測定

2.2.1 一次性灌胃實驗 各組經(jīng)一次性灌胃各受試物后，分別測定SHR 大鼠在灌胃后0，2，4，6，8，10，12，24 h 的SBP 和DBP，數(shù)據(jù)見圖1和圖2。SBP 指標中，4～10 h 間Rpep 組相比對照組極顯著下降（P＜0.01）。Cap 組在4 h 時SBP 達到最大降幅26.4 mmHg，Rpep 組SBP 下降速度緩于Cap 組，在6 h 時SBP 達到最大降幅24.4 mmHg。10 h 時血壓Cap 組的大鼠SBP 回升到最初水平，Rpep 組大鼠SBP 回升速率比Cap 組小，降血壓效果從4 h 持續(xù)到12 h。DBP 指標中，Rpep 組從2 h 到6 h 的DBP 持續(xù)下降，6 h 時達到最大降幅18.3 mmHg，相比對照組差異顯著（P＜0.05）。Cap 和Rpro 組相比對照組始終沒有差異（P＞0.05）。

2.2.2 30d 灌胃實驗 各組經(jīng)30 d 灌胃實驗后，每7 d 測量一次大鼠的SBP 和DBP，數(shù)據(jù)見圖3和圖4。SBP 指標中，Cap 和Rpep 組SBP 下降趨勢基本一致，在第2 周時達到最大降幅9.7 mmHg和12.2 mmHg，之后SBP 趨于穩(wěn)定。Rpro 相比對照組沒有差異（P＞0.05）。DBP 指標中，Cap 和Rpro組DBP 沒有明顯下降（P＞0.05），Rpep 相比對照組DBP 顯著下降（P＜0.05），試驗第4 周達到最大降幅13.3 mmHg。

Cap 組實驗結(jié)果與有關(guān)卡托普利降血壓功效的報道一致[6，16]。脫毒菜籽多肽能顯著降低SBP 和DBP（P＜0.05），雖然起效速度不如卡托普利但作用效果維持時間長。目前研究表明即使血壓的小幅下降也可以有效降低心血管疾病的發(fā)病率[18-19]，因此能長時間保持降壓效果的降壓產(chǎn)品值得關(guān)注，脫毒菜籽多肽是值得開發(fā)的良好降壓產(chǎn)品。

圖1 一次性灌胃實驗大鼠收縮壓變化Fig.1 Changes of SBP in rats in single gavaged test

圖2 一次性灌胃實驗大鼠舒張壓變化Fig.2 Changes of DBP in rats in single gavaged test

圖3 30 d 灌胃實驗大鼠收縮壓變化Fig.3 Changes of SBP in rats in 30 days gavaged test

圖4 30 d 灌胃實驗大鼠舒張壓變化Fig.4 Changes of DBP in rats in 30 days gavaged test

2.3 ACE 酶活測定

一次性灌胃和30 d 灌胃后從SHR 大鼠肺、腎、心臟和動脈中提取ACE 酶并測定ACE 酶活，結(jié)果見表2。兩次試驗結(jié)果相近，相比各對照組，Cap 組肺和動脈中酶活都有極顯著下降（P<0.01），腎顯著下降（P<0.05）。而兩個試驗的Rpep 組大鼠僅肺、腎和動脈中酶活水平顯著下降 （P<0.05），Rpro 組大鼠肺和動脈中ACE 酶活與各自對照組相比均沒有顯著差異（P>0.05）。兩個試驗中各組大鼠心臟ACE 酶活之間均沒有顯著差異（P>0.05）。脫毒菜籽多肽在肺、腎和動脈中抑制ACE 酶活作用效果明顯，而在心臟中效果不明顯。一次性灌胃脫毒菜籽多肽在動脈中ACE 抑制率最高為27.5%，在肺和腎中分別僅有7.7%和12.1%，經(jīng)30 d 灌胃脫毒菜籽多肽動脈中ACE 抑制率最高為20.5%，在肺中上升到11.5%，在腎中下降到7.9%。ACE 酶在人體腎素-血管緊張素系統(tǒng) （Reninalangiotension system，RAS） 和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Kallikrein-kinin system，KKS） 中發(fā)揮重要作用，它能夠催化血管緊張素I 生成血管緊張素II引起血壓升高[17]。在動脈、肺和腎中抑制ACE 酶活是脫毒菜籽多肽降壓的一條途徑。

表2 大鼠臟器中ACE 酶活測定Table 2 Determination of ACE enzyme activity in rat organs

2.4 臟器指數(shù)

各組經(jīng)過灌胃之后，解剖稱取各組SHR 大鼠的肺、腎、心臟、肝、脾和胃并計算臟器指數(shù)，具體數(shù)據(jù)見表3。從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)對照組、Cap 組、Rpep組和Rpro 組在肺、腎、心臟、肝、脾和胃的臟器指數(shù)上均沒有顯著性差異（P>0.05），說明試驗所制脫毒菜籽多肽和脫毒菜籽蛋白樣品對SHR 大鼠各臟器沒有明顯影響。

表3 脫毒菜籽多肽對大鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effects of detoxic rapeseed peptides on organ index in rats

2.5 血清指標測定

兩次灌胃實驗大鼠血清中各項指標含量用科研試劑盒測定，數(shù)據(jù)見表4和表5。

TNF-α 與機體炎癥反應的關(guān)系密切，細胞受到損傷時會激活TNF-α 誘導細胞炎癥反應，炎癥反應會影響動物血壓，還會引起ET-1，NO，eNOS等血清指標含量變化[18-19]。兩次灌胃實驗中對照、Cap、Rpep 和Rpro 4 個組大鼠血清中TNF-α 含量沒有差異（P>0.05）。實驗說明所制脫毒菜籽蛋白和脫毒菜籽多肽不含炎癥因子，不會引起機體炎癥反應，不會對血壓及其它血清指標含量產(chǎn)生影響。

一次性灌胃實驗中，對照、Cap、Rpep 和Rpro 4 組在ET-1 和Renin 含量指標上沒有差異（P>0.05），30 d灌胃實驗中Rpep 組ET-1 和Renin含量均極顯著下降（P<0.01）。而Rpep 組的ANGII含量在前、后兩次灌胃實驗中均顯著下降（P<0.05），降幅分別為10.7%和9.7%。內(nèi)皮素具有非常強烈的收縮血管的生物活性，目前研究發(fā)現(xiàn)3種內(nèi)皮素亞型（ET-1，ET-2，ET-3），以ET-1 的作用最強[20]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)是升壓系統(tǒng)，在腎素作用下，血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素I，經(jīng)ACE 酶酶解轉(zhuǎn)化為血管緊張素II。腎素和血管緊張素II 在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中有舉足輕重的作用。一次性灌胃實驗中，ET-1、Renin 和ANGII 3 個指標里只有ANGII 顯著下降（P<0.05），30 d 灌胃實驗中3 個指標均顯著下降（P<0.05）。說明脫毒菜籽多肽可以通過降低ET-1、Renin 和ANGII 含量起到降血壓的作用。一次性灌胃實驗由于作用時間短，脫毒菜籽多肽只能影響Renin到ANG II 作用途徑上的某種物質(zhì)，據(jù)文獻報道推測應該是ACE 酶[21-22]，其酶活被抑制了。

一次性灌胃實驗中，Rpep 組NO 和eNOS 含量最高，分別為（4.76±0.15）ng/mL 和（34.85±0.97）μIU/L，與對照組相比均有極顯著性上升（P<0.01），Rpep 組NO 含量顯著高于Cap 組（P<0.05）。30 d灌胃實驗中Rpep 組NO 含量相比對照組極顯著提高16.7%（P<0.01），eNOS 含量與對照組無顯著差異（P>0.05）。NO 是強效的內(nèi)源性血管舒張因子，eNOS 則為內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（NOS），是其主要3種亞型（nNOS，eNOS，iNOS）之 一[23]，eNOS 可以促進NO 的合成。試驗說明脫毒菜籽多肽的降血壓活性除了通過抑制ACE 活性，還能通過提高NO 和eNOS 含量實現(xiàn)，一次性灌胃時效果顯著好于卡托普利（P<0.05）。

一次性灌胃實驗中，對照、Cap、Rpep 和Rpro組間的CK-MB、LDH-1 和GST 含量均沒有顯著差異（P>0.05），但30 d 灌胃實驗中Cap 組的CKMB 和GST 含量均有顯著提高（P<0.05），而Rpep和Rpro 與對照組間沒有顯著差異（P>0.05）。CKMB、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶（LDH）等在心肌損傷或者壞死后有不同程度的增高，以CK-MB、LDH-1 的特異性最高[24]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）主要存在于肝臟內(nèi)，常在生物體受到諸如殺蟲劑、化學致癌劑、紫外輻射、極端溫度等傷害時發(fā)揮其抗氧化及解毒功能，機體受到損傷時GST 迅速釋放入血導致血清GST 活性升高，因此GST 活性反應了肝臟和機體受到的化學損傷程度[25]。試驗說明一次性灌胃各受試物不至于引起CK-MB、LDH-1、GST 含量的顯著變化，而30 d灌胃實驗中卡托普利表現(xiàn)某種毒副作用，會引起機體CK-MB 和GST 含量上升，而脫毒菜籽多肽沒有表現(xiàn)出明顯的毒副作用。

表4 一次性灌胃實驗SHR 血清指標Table 4 Serum indicators of SHR in single gavaged test

表5 30 d 灌胃實驗SHR 血清指標Table 5 Serum indicators of SHR in 30 days gavaged test

3 結(jié)論

1） 脫毒菜籽多肽沒有急性毒性、不含炎癥因子，具降低收縮壓和舒張壓的功效，相比卡托普利起效慢但效果持續(xù)時間長。

2） 脫毒菜籽多肽灌胃后作用于大鼠肺、腎和動脈組織，會抑制臟器中ACE 酶活，主要通過降低機體ET-1、Renin、ANG II 含量，提高機體NO、eNOS 含量發(fā)揮降血壓功效。