王葉青 丁慧璞 徐 旭 程 丹 王志江 劉利萍*

（1 浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江寧波315100 2 寧波大央工貿(mào)有限公司 浙江寧波315000 3 浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校制藥工程學(xué)院 浙江寧波315100）

精油也稱揮發(fā)油，是一類存在于植物體中有芳香氣味，在常溫下能揮發(fā)，可隨水蒸氣蒸餾出的油狀液體的總稱。廣泛應(yīng)用于化妝品、香料以及醫(yī)藥工業(yè)[1]。許多天然植物精油有抑菌或殺死微生物的特性[2-4]。梅林等[5]測(cè)定了八角茴香精油對(duì)痢疾桿菌、金葡菌、白喉?xiàng)U菌、傷寒桿菌的MIC 值，顯示八角茴香精油對(duì)這些微生物有較強(qiáng)的抑制作用。秦文文[6]研究了茶樹(shù)精油對(duì)5 種供試菌抑菌效果均屬于中度敏感，測(cè)得大腸埃希菌和白色葡萄球菌的MIC 為1.0%，金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、綠膿桿菌的MIC 分別為1.2%，1.4%，2.0%。黃妙玲等[7]研究了金盞花精油對(duì)皮膚有很好的抗炎及促進(jìn)細(xì)胞再生作用，對(duì)青春痘、皮膚疤痕等都有治療效果。

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，芽孢是產(chǎn)芽孢細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育后期菌體內(nèi)形成的一個(gè)圓形或橢圓形、厚壁、折光性強(qiáng)、具抗逆性的休眠體，它有驚人的耐高溫能力和抗輻射能力。由于芽孢桿菌能產(chǎn)生很強(qiáng)抗逆性的芽孢，因此是在食品工業(yè)中經(jīng)常遇到的污染菌，它們可以引起果蔬、糧食、乳制品、肉類、魚(yú)類、禽類、蛋類以及罐頭食品變質(zhì)，導(dǎo)致一些食源性疾病和食物中毒[8]。

在食品工業(yè)生產(chǎn)中，長(zhǎng)期使用山梨酸鉀、苯甲酸鈉等人工合成食品防腐劑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)食品的口感及人體健康有不良影響，因此要求嚴(yán)格限制其在食品中的用量[9]。開(kāi)發(fā)高效、安全、穩(wěn)定且廉價(jià)的新型防腐劑，具有重要意義。天然防腐劑的研究和開(kāi)發(fā)利用成為當(dāng)今食品工業(yè)的一個(gè)熱點(diǎn)[10]。天然防腐劑對(duì)人體健康無(wú)害，有些天然防腐劑已達(dá)到或超過(guò)人工合成防腐劑的效果。

本試驗(yàn)選擇自然界常見(jiàn)的8 種植物精油測(cè)定其對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性，并篩選出其中對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果較好的植物精油，測(cè)定其最低抑菌濃度，按照最低抑菌濃度復(fù)配植物精油，利用其協(xié)同增效作用以達(dá)到更好的抑菌效果。對(duì)復(fù)配植物精油的機(jī)理進(jìn)行探究，為植物精油在食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為天然防腐劑在食品貯藏保鮮中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物精油：菊花精油、冬青精油、金盞花精油、八角茴香精油、香蜂草精油、佛手柑精油、茉莉精油和野番茄精油，通過(guò)水蒸氣蒸餾法制得，于低溫4 ℃避光保存。均由寧波大央工貿(mào)有限公司提供。

尼泊金乙酯 （配制質(zhì)量濃度為50 μg/mL 使用），國(guó)藥集團(tuán)。

供試菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），于-20 ℃，斜面保存，由浙江萬(wàn)里學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 微生物培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于細(xì)菌培養(yǎng)。牛肉膏3 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂1.5～2.0 g（液體培養(yǎng)基不含瓊脂），水100 mL，pH 7.0～7.2（使用1.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值）。

1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-75SII 型壓力蒸汽滅菌器、BSP-150型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；SKY-200B 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 供試菌懸液制備 從活化的菌體斜面上挑取菌體接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。分別吸取供試菌液0.5 mL，加入無(wú)菌水倍比稀釋到105～106CFU/mL，備用。

1.4.2 8種植物精油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性取6 支50 mL 錐形瓶（編號(hào)1～6），1 號(hào)瓶中加入20 mL 培養(yǎng)基為空白；6 號(hào)瓶中加入10 mL 培養(yǎng)基與10 mL 菌懸液為陰性對(duì)照；2～5 號(hào)瓶中加入10 mL 菌懸液，再依次加入2.0，5.0，10，20 μL 植物精油，再加入培養(yǎng)液至20 mL。置于37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察培養(yǎng)液，如出現(xiàn)渾濁，表明有菌生長(zhǎng)；澄清透明，表明加入的精油有抑菌作用[11]。

1.4.3 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 選取1.4.2 節(jié)中抑菌效果好的植物精油，采用倍比稀釋法測(cè)定其MIC。取9 支50 mL 錐形瓶（編號(hào)1～9），1 號(hào)瓶中加入20 mL 培養(yǎng)基為空白；9 號(hào)瓶中加入10 mL 培養(yǎng)基與10 mL 菌懸液為陰性對(duì)照；2～8 號(hào)瓶中加入10 mL 菌懸液，再依次加入1.25，2.5，5.0，10，20，40，50 μL 植物精油，同時(shí)以同劑量的50 μg/mL 尼泊金乙酯作陽(yáng)性對(duì)照，再加入培養(yǎng)基至20 mL。置于37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定各試管中培養(yǎng)液在600 nm 波長(zhǎng)處的透光率（細(xì)菌在一定條件下，可以在其相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并能夠使培養(yǎng)基變渾濁，如果在其中加入具有抑菌效果的植物精油，則能使培養(yǎng)基保持澄清透明）。在透光率40%～60%范圍內(nèi)，確定對(duì)應(yīng)試管的植物精油濃度為對(duì)應(yīng)菌種的最低抑菌濃度。

分別取這4 種植物精油MIC 下的菌液200 μL 于固體培養(yǎng)基中涂布，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24 h，37 ℃），觀察枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況。

1.4.4 復(fù)配植物精油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制性選出1.4.2 節(jié)中抑菌效果較好的菊花精油、八角茴香精油、金盞花精油及冬青精油為因變量，MIC 為各因素的最高水平，以菌液的透光率為響應(yīng)值，做Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，按照1.4.3 節(jié)的方法測(cè)定復(fù)配精油的抑菌活性，確定菊花精油、八角茴香精油、金盞花精油以及冬青精油的最佳組合。

1.4.5 復(fù)配精油對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響 將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取出部分菌液，并分為對(duì)照組和復(fù)配精油試驗(yàn)組。對(duì)照組是將菌液直接用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基稀釋到菌體個(gè)數(shù)為105～106CFU/mL；復(fù)配精油試驗(yàn)組是將菌液加到含復(fù)配精油濃度為最佳配方的液體培養(yǎng)基中，并使得菌體個(gè)數(shù)為105～106CFU/mL。將對(duì)照組和復(fù)配精油組繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h 取樣，離心收集菌體，重懸于2 mL 生理鹽水中測(cè)A600nm值，制作對(duì)照組生長(zhǎng)曲線和復(fù)配精油試驗(yàn)組生長(zhǎng)曲線[12]，分析復(fù)配精油的抑菌特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 8 種植物精油抑菌活性的測(cè)定結(jié)果

當(dāng)精油含量在1 μL/mL 內(nèi)，8 種植物精油對(duì)枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果，依次為：八角茴香精油＞菊花精油、金盞花精油＞冬青精油＞茉莉精油、佛手柑精油＞香蜂草精油、野番茄精油。

表1 8 種植物精油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of eight plant essential oils against the Bacillus subtilis

2.2 4 種植物精油最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果

根據(jù)2.1 節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，選取其中4 種對(duì)枯草芽孢桿菌抑制活性效果較好的精油，測(cè)定其最低抑菌濃度。

由表2可知，這4 種植物精油對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別是八角茴香（0.25 μL/mL）＞金盞花（0.5 μL/mL）≈菊花（0.5 μL/mL）＞冬青精油（1.0 μL/mL），其中八角茴香精油的抑菌性比陽(yáng)性對(duì)照尼泊金酯還強(qiáng)，小于尼泊金酯的MIC 值為0.5 μL/mL。

這4 種植物精油在MIC 下對(duì)枯草芽孢桿菌都有很好的抑制作用，金盞花精油、菊花精油和冬青精油在MIC 時(shí)，殺死了絕大多數(shù)枯草芽孢桿菌及其芽孢，而八角茴香精油在MIC 時(shí)，枯草芽孢桿菌及其產(chǎn)生的芽孢都被殺死。

2.3 復(fù)配植物精油抑菌活性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表4得到植物精油復(fù)配對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)（透光率）影響規(guī)律的二次多項(xiàng)擬合方程為：

透光率（%）=86.17+5.64A+10.72B+9.58C+12.34D-4.35AB+4.39AC+5.33AD-8.53BC-1.40BD-4.28CD+0.91A2-7.58B2-11.56C2-10.67D2，R2=0.9544。

所建立的回歸模型P＜0.001，說(shuō)明模型極顯著。A，B，C，D，BC 的P＜0.05，說(shuō)明菊花精油（B）、八角茴香精油（D）、金盞花精油（C）、冬青精油（A），以及菊花精油和金盞花精油復(fù)配（BC）對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制有顯著影響。其影響大小次序?yàn)椋壕栈ň停˙）、八角茴香精油（D）>金盞花精油（C）>冬青精油（A）>菊花精油和金盞花精油復(fù)配（BC）。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，菊花精油和金盞花精油存在相互作用，兩種精油復(fù)配有相互增效作用。

圖2表示冬青精油0.5 μL/mL 和八角茴香精油0.13 μL/mL 時(shí)，菊花精油和金盞花精油對(duì)透光率的響應(yīng)面影響。菊花精油和金盞花精油對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制存在顯著協(xié)同增效作用，且隨著菊花精油和金盞花精油濃度的升高對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用變強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到一定時(shí)趨于平穩(wěn)。

通過(guò)軟件Design-Expert 8.0.6 分析得枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)抑制的最佳條件是：冬青精油為0.61 μL/mL、菊花精油為0.44 μL/mL、金盞花精油為0.24 μL/mL、八角茴香精油為0.17 μL/mL 時(shí)，透光率預(yù)測(cè)最大值為93.45%。按照上述配方，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)定得到透光率的平均值為91.05%±1.81%（91.31%，93.24%，89.7%），與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明此響應(yīng)面法得到的回歸模型可靠。

表2 4 種植物精油的最低抑菌濃度（MIC）Table 2 Minimum inhibitory concentration （MIC） of four kinds of essential oils

圖1 4 種植物精油在MIC 時(shí)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況Fig.1 The growth of Bacillus subtilis at MIC of four kinds of essential oils

表3 4 種植物精油復(fù)配的響應(yīng)面抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface test results of four kinds of essential oils complexed

表4 方差分析表Table 4 Variance analyses

圖2 菊花精油和金盞花精油對(duì)枯草芽孢桿菌的響應(yīng)面分析Fig.2 Response surface analysis of chrysanthemum essential oil and calendula essential oil to Bacillus subtilis

2.4 復(fù)配精油對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

按照2.3 節(jié)得到的抑制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的最佳精油配方進(jìn)行復(fù)配，冬青精油為0.61 μL/mL，菊花精油為0.44 μL/mL，金盞花精油為0.24 μL/mL，八角茴香精油為0.17 μL/mL，研究復(fù)配植物精油對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響。

由圖3可知，經(jīng)復(fù)配精油處理過(guò)的枯草芽孢桿菌菌種生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相比較，生長(zhǎng)緩慢，最終的菌體量不及正常生長(zhǎng)量的一半。精油復(fù)配表現(xiàn)出對(duì)微生物生長(zhǎng)抑制的協(xié)同增效作用，這與韓軍等[11]研究的肉桂、大蒜、丁香花蕾和生姜精油復(fù)配后對(duì)單核增生李斯特氏菌的抑菌增效一致。

圖3 復(fù)配精油對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 The effect of compound essential oil on growth curve of Bacillus subtilis

從圖3可以判斷復(fù)配精油主要抑制了枯草芽孢桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的分裂和繁殖，使得活菌數(shù)明顯下降，無(wú)法達(dá)到正常的生長(zhǎng)高峰，并且很快進(jìn)入衰亡期。

3 結(jié)論

開(kāi)發(fā)植物性抑菌劑已成為當(dāng)前食品保鮮的一個(gè)熱點(diǎn)。本試驗(yàn)從8 種植物精油中篩選出了對(duì)抗逆性極強(qiáng)的枯草芽孢桿菌有抑菌效果的4 種植物精油，分別是金盞花精油、菊花精油、冬青精油和八角茴香精油，這4 種植物精油對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC 值顯示，八角茴香精油的抗菌性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照尼泊金酯。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)冬青精油0.5 μL/mL、八角茴香精油0.13 μL/mL 時(shí)，菊花精油和金盞花精油對(duì)枯草芽孢桿菌存在協(xié)同增效作用；對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果最好的復(fù)配精油比例為冬青精油0.61 μL/mL+菊花精油0.44 μL/mL+金盞花精油0.24 μL/mL+八角茴香精油0.17 μL/mL 時(shí)，復(fù)配精油能有效抑制枯草芽孢桿菌數(shù)的生長(zhǎng)，其透光率達(dá)到91.05%±1.81%。本研究為天然防腐劑的研究提供了一個(gè)新的思路，可以利用植物精油經(jīng)過(guò)可行性加工，生產(chǎn)一種能用作于食品保藏、防腐的天然無(wú)毒的生物防腐劑，這對(duì)植物精油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用有一定的意義。