黃 旭 郝 吉 李 薇 蔡夢(mèng)珊 鄧旭坤 舒廣文

（中南民族大學(xué)藥學(xué)院 武漢430074）

衰老一般指高等生物各個(gè)器官系統(tǒng)的機(jī)能在時(shí)間推移過(guò)程中的逐漸衰退。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展，人口老齡化程度不斷增加，與衰老相關(guān)的一系列問(wèn)題日益嚴(yán)重。高等動(dòng)物的免疫系統(tǒng)能夠辨別體內(nèi)的非自體物質(zhì)（一般是病原體），并將其消滅或排出體外，對(duì)于維持機(jī)體正常生命活動(dòng)具有重要意義。免疫抑制是衰老的重要特征之一[1-4]。

石榴（Punica granatum Linn.）是石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，在我國(guó)各地均有廣泛栽培。石榴籽油（Punica granatum seed oil，PGSO）是從石榴的種子中提取的揮發(fā)油。研究表明，PGSO 具有廣泛的生物學(xué)活性[5-7]。然而，目前尚不清楚PGSO 是否可以改善衰老相關(guān)的免疫抑制。本文以D-半乳糖（D-Gal）誘導(dǎo)的衰老小鼠為研究模型，探討PGSO 對(duì)免疫抑制的干預(yù)作用，旨在為PGSO在免疫調(diào)節(jié)功能性食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)材料、試劑與試劑盒

無(wú)特定病原體 （Specific pathogen free，SPF）級(jí)8 周齡雄性昆明小鼠（20±2）g，湖北省疾病預(yù)防控制中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK （鄂）2015-0018。小鼠飼養(yǎng)于SPF 動(dòng)物房?jī)?nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。依已有文獻(xiàn)報(bào)道的方法制備石榴籽油[8-9]。

維生素E（VE），浙江醫(yī)藥股份有限公司；DGal、RNaseA、刀豆蛋白A （ConA）、細(xì)菌脂多糖（LPS），美國(guó)Sigma Aldrich 公司；臺(tái)盼藍(lán)、中性紅、MTT 和碘化丙啶（PI），西安Wolsen 生物技術(shù)研究所；RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液，美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清，天杭生物科技股份有限公司。其它常規(guī)化學(xué)試劑（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。NO 含量測(cè)試試劑盒、caspase-1 活性檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；IL-1β 酶聯(lián)免疫試劑盒，南京建成生物技術(shù)研究所；免疫球蛋白和補(bǔ)體含量測(cè)試試劑盒，美國(guó)Ortho-Clinical Diagnostics 公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（5810R 型），德國(guó)Eppendorf公司；HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠；流式細(xì)胞儀 （Becton Dickinson FACSCalibur），美國(guó)Franklin Lakes 公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（317 型）、多功能酶標(biāo)儀（354 型），美國(guó)Thermo 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物的分組與給藥 將60 只小鼠分別隨機(jī)分為6 組，每組10 只，分別是健康對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（VE，200 mg/kg）、PSGO 低劑量組（75 mg/kg）、PSGO 中劑量組（250 mg/kg）和PSGO高劑量組（750 mg/kg）。健康對(duì)照組每日皮下注射0.5 mL 生理鹽水。其余各組每日皮下注射0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的D-Gal 溶液。VE 和PGSO 均通過(guò)灌胃途徑給藥。給藥時(shí)間持續(xù)45 d。末次給藥24 h 后，分離培養(yǎng)原代巨噬細(xì)胞。然后麻醉小鼠，取血，收集血清。最后處死小鼠，迅速解剖，摘取相關(guān)組織器官進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與吞噬能力測(cè)定將4 mL 無(wú)血清的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液注射入小鼠腹腔內(nèi)。輕揉小鼠腹部，使培養(yǎng)液在腹腔內(nèi)流動(dòng)均勻。15 min 后，抽取腹水，離心收集腹水中的細(xì)胞，再用培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞多次。最后，將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞存活率大于95%后，將細(xì)胞濃度調(diào)整到2×106/mL，備用。

將所得巨噬細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔0.1 mL，于5%CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)4 h。用生理鹽水洗去未貼壁的細(xì)胞，向每孔中添加0.04%的中性紅溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，用生理鹽水洗滌3 次，最后加入乙醇-乙酸（1∶1）混合液200 μL，靜置12 h。測(cè)定每孔溶液在波長(zhǎng)570 nm 處的吸光度D（λ）。此吸光度可以代表巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

1.3.3 巨噬細(xì)胞IL-1β 和NO 分泌能力檢測(cè)以及巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β 含量和caspase-1 活性檢測(cè)向巨噬細(xì)胞懸液中加入LPS，至LPS 終質(zhì)量濃度為20 μg/mL，24 h 后，收集其培養(yǎng)液上清，利用相應(yīng)的試劑盒，檢測(cè)培養(yǎng)液中NO 和IL-1β 的含量。然后收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后利用相應(yīng)的試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的IL-1β 含量及caspase-1 的相對(duì)活性。

1.3.4 脾臟/胸腺指數(shù)計(jì)算、脾臟/胸腺細(xì)胞分離與ConA 刺激脾臟與胸腺細(xì)胞增殖檢測(cè) 處死小鼠后迅速解剖，摘取脾臟與胸腺，稱(chēng)重，計(jì)算脾臟與胸腺指數(shù)。計(jì)算公式：臟器指數(shù)= 臟器質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量 （g）。將脾臟/胸腺放入低溫?zé)o血清RPMI-1640 培養(yǎng)液內(nèi)，剪碎、研磨，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，即得脾臟/胸腺細(xì)胞懸液。漂洗后立即向細(xì)胞懸液中加入0.15 mol/L 的NH4Cl （pH=7.4）溶液以去除紅細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色確定細(xì)胞存活率大于95%后，將細(xì)胞接種入96 孔板中，接種密度為每孔5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h（5%CO2，37 ℃）。

向試驗(yàn)孔中加入含有ConA（2 μg/mL）的RPMI-1640 培養(yǎng)液100 μL，陰性對(duì)照孔中加等體積RPMI-1640 培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，每孔加入MTT（2.0 mg/mL）50 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后移去培養(yǎng)液，每孔加15 μL DMSO，徹底混合，測(cè)定每孔溶液在波長(zhǎng)570 nm 處的光密度。以試驗(yàn)孔和對(duì)照孔光密度的比值代表ConA 刺激下免疫細(xì)胞的增殖能力。

1.3.5 流式細(xì)胞分析 用貯存于-20 ℃的70%乙醇固定脾臟細(xì)胞懸液，至少2 h 后，再用含20 mmol/L EDTA 的生理鹽水洗滌3 次。向樣品中加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的RNaseA，37 ℃孵育1 h。最后向樣品中加入20 μg/mL 的PI 染液，混勻后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分布分析。

1.3.6 血清免疫球蛋白及補(bǔ)體含量檢測(cè) 按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)量各組小鼠血清免疫球蛋白IgM、IgG、IgA 和補(bǔ)體C3、C4 的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，以spss 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t 檢驗(yàn)法比較模型組和健康組數(shù)據(jù)差別的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如數(shù)據(jù)分析涉及的組多于2 個(gè) （如模型組和2 個(gè)PGSO給藥組的比較），則先采用單因素方差分析法，比較多個(gè)試驗(yàn)組的數(shù)據(jù)差別，再采用Scheffe 法進(jìn)行均數(shù)兩兩比較檢驗(yàn)。P<0.05 時(shí)，可以認(rèn)為數(shù)據(jù)的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠脾臟指數(shù)與ConA 刺激的脾細(xì)胞增殖的影響

脾臟是機(jī)體重要的免疫器官。如表1所示，與健康組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)降低了13.7%，ConA 刺激指數(shù)降低了38.3%（P<0.01）。與模型組相比，在PGSO 低、中和高劑量組中，脾臟指數(shù)分別上升了6.1%，9.5%和15.4%，ConA 刺激指數(shù)則分別上升了17.9%，43.4%和66.9%。而在陽(yáng)性對(duì)照VE 組中，脾臟指數(shù)上升了13.4%，ConA 刺激指數(shù)上升了56.6%。以上結(jié)果表明，PGSO 能夠顯著提高D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠的脾臟指數(shù)和脾細(xì)胞增殖能力，其作用效果與陽(yáng)性對(duì)照藥VE 相當(dāng)。

表1 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠脾臟指數(shù)與ConA 刺激的脾細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effects of PGSO on spleen index and ConA-mediated splenocyte proliferation of aging mice induced by D-Gal

2.2 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠胸腺指數(shù)與ConA 刺激的胸腺細(xì)胞增殖的影響

胸腺是機(jī)體另一重要的免疫中樞。如表2所示，與健康小鼠相比，衰老模型小鼠的胸腺指數(shù)降低了34.7%，ConA 刺激指數(shù)降低了44.7%（P<0.01）。與模型組相比，PGSO 劑量依賴(lài)性地提高了衰老小鼠的胸腺指數(shù)和ConA 刺激胸腺細(xì)胞增殖。在PGSO 低、中和高劑量組中，小鼠胸腺指數(shù)分別上升了20.7%，42.0%和61.7%，ConA 胸腺刺激指數(shù)則分別上升了26.5%，48.3%和82.3%（P<0.01）。PGSO 的干預(yù)作用與陽(yáng)性藥物VE 相當(dāng)。以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，PGSO 可明顯提高D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠的胸腺指數(shù)和胸腺細(xì)胞增殖能力。

表2 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠胸腺指數(shù)與ConA 刺激的胸腺細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effects of PGSO on thymus index and ConA-mediated proliferation of thymus cells of aging mice induced by D-Gal

2.3 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠脾臟細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響

脾臟細(xì)胞周期時(shí)相分布與脾臟的免疫功能緊密相關(guān)。一般而言，處于S 期和G2/M 期的細(xì)胞是正在分裂的細(xì)胞。這部分細(xì)胞在脾臟中所占比例越大，脾臟細(xì)胞的增殖能力就越強(qiáng)。處于亞G1 期（Sub G1 期）的細(xì)胞一般是細(xì)胞內(nèi)DNA 出現(xiàn)片段化、發(fā)生凋亡的細(xì)胞。這部分細(xì)胞在脾臟中所占比例越大，脾臟的免疫功能就越弱。如表3所示，與健康組比較，模型組小鼠脾臟細(xì)胞處于亞G1 期的比例大幅升高（P<0.01），而處于S 期及G2/M 期的比例則分別降低了40.7%和60.0%（P<0.01）。這說(shuō)明在衰老模型小鼠的脾臟中，正在分裂的細(xì)胞所占比例明顯降低，而凋亡細(xì)胞所占比例則明顯增加。與模型組比較，PSGO 各劑量組小鼠脾臟細(xì)胞亞G1 期細(xì)胞所占比例均顯著降低（P<0.01），而處于S 期及G2/M 期的細(xì)胞比例均明顯升高（P<0.01）。代表性的流式細(xì)胞分析圖譜參見(jiàn)圖1。PSGO 的干預(yù)效果與陽(yáng)性藥物VE 相當(dāng)。這些數(shù)據(jù)綜合說(shuō)明，PSGO 能夠抑制脾臟細(xì)胞凋亡并加強(qiáng)脾細(xì)胞增殖。

表3 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠脾臟細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響Table 3 Effects of PGSO on cell cycle distribution of splenocytes of D-Gal-induced aging mice

圖1 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠脾臟細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響Fig.1 Effects of PGSO on cell cycle distribution of splenocytes of D-Gal-induced aging mice

2.4 PGSO 對(duì)衰老模型小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響

巨噬細(xì)胞能夠吞噬侵入機(jī)體的非自體物質(zhì)。IL-1β 和NO 是巨噬細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)因子。它們?cè)跈C(jī)體免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演了重要角色[10-12]。如表4所示，與健康組相比，模型組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力明顯下降（P<0.01）。IL-1β 和NO 的分泌能力也明顯低于健康組（P<0.01）。經(jīng)PGSO 干預(yù)后，衰老模型小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力以及分泌IL-1β 和NO 的能力均明顯上升（P<0.01）。PSGO的干預(yù)效果與陽(yáng)性對(duì)照藥VE 相當(dāng)。

巨噬細(xì)胞內(nèi)以前體形式表達(dá)的IL-1β 蛋白需經(jīng)過(guò)蛋白酶caspase-1 的切割加工后才能成熟[13-14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，模型組小鼠巨噬細(xì)胞的IL-1β 蛋白含量與caspase-1 活性均明顯下降（P<0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照藥物VE 類(lèi)似，PGSO 明顯提高了巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β 蛋白的含量以及caspase-1 活性（P<0.01）。試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。以上數(shù)據(jù)綜合說(shuō)明，PGSO 能顯著改善衰老模型小鼠的巨噬細(xì)胞功能。

表4 PGSO 對(duì)衰老小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力以及IL-1β 和NO 分泌能力的影響Table 4 Effects of PGSO on the ability of endocytosis and IL-1β/NO secretion of macrophages derived from aging mice

表5 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β 含量和caspase-1 活性的影響Table 5 Effects of PGSO on intracellular IL-1β content and caspase-1 activity in macrophages derived from aging mice

2.5 PGSO 對(duì)衰老模型小鼠血清免疫球蛋白和補(bǔ)體含量的影響

免疫球蛋白和補(bǔ)體是高等動(dòng)物體液免疫的重要組成成分。與健康組相比，衰老小鼠血清內(nèi)免疫球蛋白IgG、IgM 和IgA 的含量均明顯下降（P<0.01）。PGSO 劑量依賴(lài)性地上調(diào)了衰老小鼠血清中3 種免疫球蛋白的含量（PGSO 各劑量組數(shù)據(jù)均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01）。試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。類(lèi)似的，在衰老小鼠體內(nèi)，血清補(bǔ)體C3 和C4 的含量較健康小鼠均明顯下降（P<0.01）。經(jīng)口服PGSO劑量依賴(lài)性地提高了衰老小鼠血清中補(bǔ)體C3 和C4 的含量。試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表6 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠血清免疫球蛋白含量的影響Table 6 Effects of PGSO on immunoglobin contents in serum from D-Gal-induced aging mice

表7 PGSO 對(duì)D-Gal 誘導(dǎo)衰老小鼠血清補(bǔ)體含量的影響Table 7 Effects of PGSO on complement contents in serum from D-Gal-induced aging mice

3 結(jié)論與討論

在衰老模型小鼠體內(nèi)，脾臟/胸腺指數(shù)均有明顯降低。與此一致的是，ConA 刺激的脾臟/胸腺細(xì)胞增殖亦明顯降低，處于分裂期的脾臟細(xì)胞比例減少。以上試驗(yàn)事實(shí)說(shuō)明在衰老模型小鼠體內(nèi)發(fā)生了明顯的免疫器官萎縮。已有研究表明，在DGal 誘導(dǎo)的衰老小鼠體內(nèi)，可以觀察到明顯的脾臟/胸腺指數(shù)下降[15-16]。這與本文的研究結(jié)果一致。PGSO 劑量依賴(lài)性提高了衰老動(dòng)物的脾臟/胸腺指數(shù)以及處于分裂期的脾細(xì)胞所占的比例，增強(qiáng)了脾臟、胸腺細(xì)胞的增殖能力。以上研究結(jié)果說(shuō)明PGSO 可改善衰老模型小鼠的免疫器官萎縮。

巨噬細(xì)胞是高等動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要組成成分。通過(guò)直接的吞噬作用，巨噬細(xì)胞可以清除機(jī)體內(nèi)的有害異物——主要包括病原微生物以及已經(jīng)死亡或發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。不僅如此，巨噬細(xì)胞還可以被病原體激活?；罨木奘杉?xì)胞將迅速分泌一系列免疫調(diào)節(jié)因子。這些因子將啟動(dòng)更加深層次的免疫應(yīng)答[17-18]。LPS 是常見(jiàn)病原微生物革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的代表性化學(xué)成分。在LPS 的刺激下，巨噬細(xì)胞將活化并進(jìn)一步分泌以NO 和IL-1β 為代表的免疫因子。這些免疫因子在調(diào)節(jié)機(jī)體進(jìn)一步的免疫應(yīng)答過(guò)程中扮演了重要的角色。在一些免疫抑制的動(dòng)物模型中，巨噬細(xì)胞的吞噬功能和免疫因子分泌功能都受到了損害[19-20]。在衰老模型小鼠體內(nèi)，巨噬細(xì)胞吞噬中性紅染料和對(duì)LPS 刺激的響應(yīng)能力均明顯降低。而PGSO 則有效改善了衰老模型小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞功能的下降。

免疫球蛋白在高等動(dòng)物體液免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是免疫系統(tǒng)的有機(jī)組成成分之一。在血清中，IgG 的含量較高。IgG 具有包括抗菌，抗病毒，抗腫瘤在內(nèi)的多種復(fù)雜的免疫活性[21]。IgA在血清中的含量?jī)H次于IgG。IgA 在局部黏膜免疫過(guò)程中扮演了重要角色。尤其值得注意的是，IgA對(duì)經(jīng)黏膜感染機(jī)體的病原微生物具有較強(qiáng)的抵抗作用[22-23]。IgM 的相對(duì)分子質(zhì)量大于IgG 和IgA，在中和毒素及抵御病原體感染過(guò)程中起到重要作用[24]。補(bǔ)體是血清內(nèi)另一種主要的體液免疫因子。激活的補(bǔ)體可協(xié)同機(jī)體免疫系統(tǒng)的其它組分消滅侵入機(jī)體的病原體[25-26]。在衰老模型小鼠的血清中，3 種免疫球蛋白的含量均較健康小鼠明顯下降。不僅如此，補(bǔ)體C3 和C4 的水平亦顯著降低。PGSO 劑量依賴(lài)性地提高了衰老小鼠血清中的免疫球蛋白和補(bǔ)體含量，提示PGSO 能改善衰老模型小鼠的體液免疫。