徐楗熒, 崔紅晶, 蔡桂豐, 曲仕浩

珠海市婦幼保健院 1生殖醫(yī)學中心， 3泌尿外科(廣東珠海 519000); 2廣東醫(yī)科大學東莞科研管理中心(廣東東莞 523000)

絨毛膜癌(choriocarcinoma)是一種高度惡性的腫瘤，以異常滋養(yǎng)細胞增生為特征，伴有明顯出血和壞死[1]。絨癌惡性程度極高，發(fā)生轉(zhuǎn)移早而廣泛，在化療藥物問世以前，其病死率高達90%以上[2]。目前絨癌治療以化療為主，輔以手術(shù)和放療；但是化療不良反應(yīng)重，而且患者對化療藥物易產(chǎn)生耐藥。因此，如何能夠?qū)ふ业揭环N對人體毒性不良反應(yīng)小、治療效果好的新型天然輔助治療藥物是臨床亟待解決的問題。花姜酮(Zerumbone, ZER)是從紅球姜根莖中提取的一種天然植物成分，具有抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡、抑制炎癥反應(yīng)及抗氧化等多種功效，在人體其安全性已得到證實[3]。ZER在女性生殖系統(tǒng)乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌中有研究報道[4-5]，但在絨癌中未見相關(guān)研究。本研究2018年10月至2019年2月，探討ZER對人絨毛膜癌JEG-3細胞增殖和細胞周期的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 人絨毛膜癌JEG-3細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 ZER(純度≥95%)購自Sigma公司；MEM(minimum Eagle medium)培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗和胰酶均購自Gibco公司；CCK-8(Cell Counting Kit-8) 試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理 人絨毛膜癌JEG-3細胞復蘇后離心，用MEM完全培養(yǎng)液置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，換液的時間由細胞生長速度情況而定。待細胞生長融合度達80%以上時，胰蛋白酶消化后進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8檢測細胞的活性及增殖 用胰酶消化對數(shù)生長期JEG-3細胞，800 r/min離心3 min，MEM完全培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)后稀釋制為濃度5×104·mL-1細胞懸液，取3塊96孔板進行實驗，每孔加入細胞懸液100 μL。細胞貼壁生長后，實驗組分別加入終濃度為10、25和50 μmol/L的ZER培養(yǎng)液(10 μmol/L ZER組、25 μmol/L ZER組、50 μmol/L ZER組)，對照組加入與實驗組等體積的MEM完全培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、飽和濕度)內(nèi)分別培養(yǎng)24、48和72 h后棄掉含藥培養(yǎng)液，更換新鮮的完全培養(yǎng)液100 μL/孔，每孔分別加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h，酶標儀測定OD450 nm吸光值。

1.2.3 流式細胞術(shù)分析細胞周期 取對數(shù)生長期的JEG-3細胞，藥物處理前1 d，取5×105個細胞接種在6孔板上，每孔加入2 mL MEM完全培養(yǎng)液，加藥前細胞融合度達到80%，實驗組分別加入終濃度為10、25和50 μmol/L的ZER培養(yǎng)液，對照組加入與實驗組等體積的MEM完全培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、飽和濕度)內(nèi)分別培養(yǎng)24、48和72 h后用Trypsin-EDTA消化，每樣收集1×106個細胞。離心收集細胞，用PBS洗滌細胞2次后加入預冷的70%乙醇4℃固定過夜。次日離心去除乙醇后收集細胞，PBS洗滌細胞一次，加入500 μL含50 μg/mL Propidium iodide、100 μg/mL RNase A及0.2% Triton X-100的PBS，4℃避光孵育30 min。在488 nm波長處用流式細胞儀檢測紅色熒光。

2 結(jié)果

2.1 花姜酮對JEG-3細胞增殖的影響 25 μmol/L ZER組、50 μmol/L ZER組與對照組比較，細胞增殖受到抑制，且具有濃度依賴性(P<0.05)；但是10 μmol/L ZER組與對照組比較，細胞增殖無明顯抑制(P>0.05)。50 μmol/L ZER組隨著時間的延長，細胞增殖受到顯著抑制，具有時間依賴性(P<0.01)。見表1。

組別n24 h48 h72 h對照組30.65±0.020.94±0.011.80±0.0210 μmol/L ZER組30.63±0.020.90±0.011.79±0.0125 μmol/L ZER組30.58±0.03?△0.67±0.04?△1.11±0.04?△50 μmol/L ZER組30.53±0.02?△#0.49±0.01?△#▲0.37±0.01?△#▲■

*與對照組比較P<0.01;△與10 μmol/L ZER組比較P<0.05;#與25 μmol/L ZER組比較P<0.05；▲與本組24 h比較P<0.01，■與本組48 h比較P<0.01

2.2 ZER對JEG-3細胞周期的影響 與對照組比較，25 μmol/L ZER組、50 μmol/L ZER組G0/G1期峰值變低，細胞數(shù)量減少(P<0.01)；G2/M期峰值變高，細胞數(shù)量增多(P<0.01)，細胞周期阻滯在G2/M期。見表2和圖1。

3 討論

目前關(guān)于植物中提取的單體成分及其藥用價值的研究在國際上備受關(guān)注。中國科學家屠呦呦從植物黃花蒿莖葉中提取的青蒿素，能夠有效治療瘧疾，并且具有速效和低毒的特點而獲得2015年諾貝爾生理醫(yī)學獎[6]。野生紅球姜是姜科植物的一種，原產(chǎn)于東南亞，因其具有較高的藥用價值在印度、馬來西亞、中國、孟加拉國、越南、日本、緬甸等國家均有種植[7]?；ń菑募t球姜根莖中提取的含有共軛二烯酮結(jié)構(gòu)的單環(huán)倍半萜類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化、抗過敏、抗血管生成及緩解神經(jīng)痛等多種功效[8-10]。

表2 ZER對JEG-3細胞周期的影響 %

*與對照組比較P<0.01

圖1 ZER對JEG-3細胞周期的影響

惡性變的滋養(yǎng)細胞具有更強的增殖能力，滋養(yǎng)細胞表現(xiàn)出異常增殖與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[11]。滋養(yǎng)細胞基因異常表達導致增生異常，?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine-upregulated gene 1, TUG1)是一種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，能促進人絨毛膜癌JEG-3細胞增殖[12]。研究顯示[13]，ZER能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，ZER通過影響人結(jié)腸腺癌細胞線粒體跨膜電位抑制細胞增殖，在黑色素瘤細胞中ZER通過改變線粒體功能抑制腫瘤細胞的增殖。本研究應(yīng)用CCK-8法檢測ZER對絨毛膜癌JEG-3細胞增殖的影響。CCK-8法操作簡便而準確，與MTT法比較具有水溶性好、靈敏度高、檢測時間短、細胞毒性低等優(yōu)點，屬于MTT的升級產(chǎn)品，應(yīng)用于藥物篩選和細胞增殖檢測。本研究對JEG-3細胞增殖檢測結(jié)果顯示，25 μmol/L ZER組、50 μmol/L ZER組與對照組比較，細胞增殖受到抑制，具有濃度依賴性(P<0.05)；但是10 μmol/L ZER組與對照組比較，細胞增殖無明顯抑制(P>0.05)。50 μmol/L ZER組隨著時間的延長，細胞增殖受到顯著抑制，具有時間依賴性(P<0.01)。

細胞周期是細胞從一次分裂形成子細胞開始到下一次分裂形成子細胞結(jié)束所經(jīng)歷的全部過程。在此過程中，細胞的遺傳物質(zhì)被復制并且平均配到兩個子細胞中。在絨癌細胞系的研究中，F(xiàn)10基因通過上調(diào)與細胞周期關(guān)系密切的正相關(guān)調(diào)節(jié)因子細胞周期蛋白(cyclin)-CDK復合物表達，加快絨癌細胞周期進程，增強絨癌細胞的分裂增殖活動能力，引起細胞生長失控[14-15]。激活細胞周期基因引起的細胞周期進程失調(diào)是腫瘤細胞的主要特征之一，細胞周期的進展受到cyclin和其依賴激酶復合物表達及活性的調(diào)控，ZER能夠抑制cyclin B1和其依賴激酶復合物的表達，從而阻滯腫瘤細胞的細胞周期[16]。本研究表明，25、50 μmol/L ZER處理人絨毛膜癌JEG-3細胞72 h，G0/G1期峰值變低，細胞數(shù)量減少(P<0.01)；G2/M期峰值變高，細胞數(shù)量增多(P<0.01)，細胞周期阻滯在G2/M期。此結(jié)果與ZER在卵巢癌和宮頸癌中的研究[17]一致。細胞周期G2/M的進展由 cyclin B1和Cdk1組成的激酶復合物調(diào)控，ZER能夠下調(diào)這兩種蛋白；而且，ZER引起的細胞周期阻滯是不可逆轉(zhuǎn)的[18]。

人絨毛膜癌早期即發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是該疾病的主要特征之一，腫瘤細胞的遷移及黏附能力與遠處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。有研究顯示[19]，上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)信號通路中蛋白改變參與腫瘤細胞的遷移和黏附過程，烯丙胺-17-脫甲氧格爾得霉素(17-allylamino-17-desmethoxy geldanamycin, 17-AAG)通過上調(diào)EMT信號通路中E-cadhein蛋白及下調(diào)N-cadhein、β-catenin蛋白抑制絨癌細胞的遷移和黏附過程。本研究應(yīng)用人絨毛膜癌JEG-3細胞系研究ZER對細胞增殖及細胞周期的影響，結(jié)果提示ZER可能通過抑制絨毛膜癌細胞增殖及阻滯細胞周期在G2/M期從而抑制腫瘤的生長。后續(xù)將對ZER是否影響絨癌細胞遷移、侵襲、黏附及相關(guān)的信號通路進行研究。本研究為絨癌治療提供了新的思路，花姜酮有望成為絨癌化療方案的新型輔助治療藥物。