彭瑛， 詹小亭， 鄧正華， 鄧瑩瑩， 溫先勇

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科 (四川瀘州 646000)

G6PD缺乏癥是一種X連鎖不完全顯性遺傳性溶血性酶缺陷疾病，呈全球分布，患病率高達5%[1]。貧血、溶血、黃疸是該病的主要臨床癥狀。中國G6PD 缺乏癥具有地域異質(zhì)性和種族差異性，發(fā)病率“南高北低”。全球范圍內(nèi)已經(jīng)鑒定出了140多種突變類型[2]，在中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過35種點突變[3]，G1388A、G1376T和A95G是國內(nèi)最常見的突變[4-9]。廣東、海南、廣西、云南、貴州和四川是國內(nèi)該病的高發(fā)地，人群的基因突變攜帶率可達16%[10]，本文采用多色探針熒光PCR熔解曲線法(multicolor melting curve analysis，MMCA法)對來自云南、貴州和四川共 450例疑似G6PD缺乏癥患者進行G6PD基因突變檢測，并比較不同基因型之間臨床表型的差異，旨在為G6PD缺乏癥的診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 來自2017年4月至2018年6月在本院就診的疑似G6PD缺乏癥的門診和住院患者(以不同程度的貧血、肝脾腫大、黃疸或血紅蛋白尿等臨床表現(xiàn)首次就診)450例，包括四川319例，云南59例，貴州72例?；颊吣挲g0～15歲,平均(22.06±37.27)個月。男346例，女104例，男∶女為3.23∶1。<1歲的患兒307例，≥1歲的患兒143例。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 標本的處理 采集患者EDTA-K2抗凝靜脈血3 mL，首先提取200 μL外周血提取DNA，-20℃保存待檢，然后檢測酶活性。

1.2.2 主要儀器和試劑 使用廈門致善生物科技公司提供的磁珠法核酸提取試劑盒，用配套的Lab-Aid 824全自動核酸提取儀進行DNA的提取，用該公司基因突變檢測試劑盒(含中國人常見的16種基因型：1388G>A、1387C>T、1381G>A、1376G>T、1360C>T、1024C>T、1004C>A、871G>A、592C>T、519C>T、517T>C、493A>G、487G>A、392G>T、383T>C、95A>G)在美國BIO-RAD公司出產(chǎn)的CFX96實時熒光PCR分析儀上擴增，根據(jù)多色探針熒光PCR熔解曲線法原理檢測G6PD基因型。采用北京利德曼生化公司提供的試劑用SIMENS ADVIA2400全自動生化分析儀，用紫外速率定量法，檢測G6PD酶活性，參考值范圍為1 300～5 000 U/L。

2 結(jié)果

2.1 G6PD基因檢測結(jié)果 450例疑似G6PD缺乏癥患者中檢出216例基因突變，共發(fā)現(xiàn)11個突變位點，其中有1例女性患兒為1388G>A和1004C>A復合型突變(未納入以下所有統(tǒng)計數(shù)據(jù))。各突變位點所占百分比由高到低分別為1388G>A 型29.78%(64/215)；1376G>T型 24.65%(53/215)；1024C>T 型22.33%(48/215)；95A>G型 12.09%(26/215)；871G>A型 4.05%(10/215)；392G>T型 2.33%(5/215)；517T>C型 1.39%(3/215)；487G>T型 0.93%(2/215)；1004C>A型 0.93%(2/215)；1387C>T型 0.47%(1/215)；1360C>T型 0.47%(1/215)。前3種主要突變位點占陽性檢出率的76.7%(165/215)，后5種少見突變位點僅占4.2%(9/215)。

2.2 川、滇、黔三地G6PD基因檢測結(jié)果 川、滇、黔三地區(qū)分別檢出10、7和5種突變位點。川、滇、黔所占比例最高的突變位點分別是1388G>A、1376G>T、1024C>T，1388G>A、1376G>T、1024C>T和1376G>T、1388G>A、1024C>T。三種優(yōu)勢基因在川、滇、黔三地分部經(jīng)2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義(2=0.797、0.675和0.777,P=0.671、0.713和0.678)。見表1。

表1川、滇、黔三地G6PD基因突變型的比較例(%)

2.3 酶活性與不同基因型的比較 有38例患兒酶活性降低(女7例，男32例)，未發(fā)現(xiàn)基因突變。215例基因突變患兒中發(fā)現(xiàn)24例(男5例，女19例)酶活性檢測正常。男性全部為半合子純合突變，43例女性患者中雜合突變88.4%(38例)，純合突變占11.6%(5例)。男女酶活性分別為(372.92±294.67,1 151.52±629.78)，方差不齊(F=27.539，P=0.000)，采用非參數(shù)秩和檢驗，兩者差異有統(tǒng)計學意義(z=-7.225，P=0.000)。用方差分析分別對男性和女性不同基因突變型別之間酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.680、1.629，P=0.666、0.177)。見表2。

組別男(n=172)女(n=43)1388G>A362.09±349.561 361.72±725.281376G>T340.69±312.24756.00±543.581024C>T410.35±137.211 339.60±459.0095A>G389.50±378.19862.17±576.48871G>A183.67±120.551 026.00±198.31392G>T403.41±168.070其他297.33±140.891 482.50±137.89

2.4 年齡、性別與不同基因型的關(guān)系 <1歲患兒中以1024C>T(28.0%)比例最高，其次是1388G>A(25.6%) 和1376G>T(25.0%)，≥1歲的患兒1388G>A(43.1%)比例最高，其次是1376G>T(23.5%) 和95A>G(15.7%)。經(jīng)2檢驗1024C>和1388G>A型兩年齡段比較差異有統(tǒng)計學意義(2=13.059和5.517,P=0.000和0.017)，1376G>T和95A>G型在兩年齡段差異無統(tǒng)計學意義(2=0.045和0.812,P=0.831和0.368)。見表3。

215例突變患兒中，男性172例，女性43例，提示男性發(fā)病多于女性，男女比例為4∶1。男性患兒以1388G>A(26.7%)、1376G>T(26.2%)和1024C>T(25.0%)為主，女性以1388 G>A (41.9%)、1376 G>T (18.6%)和95 A>G (14.0%)為主，經(jīng)2檢驗，前3種主要基因突變型在不同性別組中比較，差異無統(tǒng)計學意義(2=3.760、1.058和3.547，P=0.052、0.304和0.060)。見表4。

表3 發(fā)病年齡與不同基因突變型的比較 例(%)

表4 各基因突變型與性別的比較 例(%)

2.5 臨床表現(xiàn)與不同基因型的關(guān)系 215例基因突變的患兒中，肝腫大、貧血、黃疸和尿色改變?yōu)橹饕呐R床癥狀，伴有脾大、嘔吐、發(fā)熱、腹痛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等臨床癥狀。其中黃疸患兒所占比例為95.81%(206例)，貧血占96.28%(207例)，肝腫大占64.19%(138例)，發(fā)熱占58.60%(126例)，嘔吐占54.88%(118例)，腹痛占31.16%(67例)，CNS占63.26%(136例)，尿色改變占93.49%(201例)，尿量減少者占49.30%(106例)，脾臟腫大占35.35%(76例)。經(jīng)2或Fisher精確概率法檢驗，不同基因型與臨床表現(xiàn)之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

3 討論

G6PD基因位于性染色體X長臂2區(qū)8帶[11],G6PD缺乏癥具有伴X不完全顯性遺傳病的特點，女性患者的基因型有純合子(XAXA)和雜合子(XAXa)2種，男性患者的基因型只有半合子(XAY)。男性半合子和女性純合子常表現(xiàn)G6PD酶活性顯著缺乏，臨床癥狀嚴重；而女性雜合子基因型和表型差異大，G6PD活性可正常，可缺乏[12]。女性以雜合突變居多臨床癥狀輕微甚至終生不發(fā)作。因此酶活性檢測對有臨床癥狀的純合突變具有診斷價值，而對沒有臨床癥狀的雜合突變患者則需要通過基因檢測來幫助診斷。

表5 臨床癥狀與G6PD各基因突變型的比較 例

本研究采用多色探針熒光PCR熔解曲線法對450例疑似G6PD缺乏癥患兒檢出基因突變216例，發(fā)現(xiàn)11個基因突變位點。國內(nèi)最常見的3種基因型為1388G>A、1376G>T和95A>G在本地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，1388G>A、1376G>T和1024C>T占陽性檢出率的76.7%，而95A>G檢出率低于1024C>T(1024C>T 22.33%,95A>G 12.09%)，主要突變與粵東潮州和海南澄邁縣學者研究報道[13-15]基本一致，但本地區(qū)1388G>A和1024C>T檢出率明顯偏高，且1388G>A居首位。同時與本地區(qū)相鄰的重慶、成都地區(qū)相比發(fā)現(xiàn)：重慶地區(qū)以1388G>A、1376G>T和95A>G為主[16-17]。四川成都以1388G>A、1376G>T和G487A為主，而1024C>T型突變不常見[18]。川、滇、黔三地之間優(yōu)勢基因所占比例也有一定的差別，四川和云南1388G>A居首位，1376G>T和1024C>T次之，而貴州以1376G>T為首，1388G>A和1024C>T次之。該研究貴州籍與貴州省其他學者報道結(jié)果不一致，劉維亮等[19]研究貴州以G1376T、G1388A及A95G為主，黃盛文等[20]報道貴陽以1388G>A、1024C>T 和519C>T為主要突變型；云南籍主要突變型百分率與其他學者對云南部分地區(qū)人群的研究結(jié)果不一致[21-22]。這些結(jié)果進一步說明了不同地區(qū)不同人群的G6PD基因突變譜不同，其基因突變具有較高的遺傳多態(tài)性。

本研究發(fā)現(xiàn)871G>A 和392G>T所占比例也較高，分別檢出10例和5例占 4.05%和2.33%，一些少見的突變型517T>C、487G>T、1004C>A、1387C>T 和1360C>T在本地區(qū)也有檢出，還檢出1例女性患兒1388G>A與1004C>A復合突變。以上突變結(jié)果顯示了本地區(qū)G6PD缺乏癥患兒基因突變型既有國內(nèi)的熱點突變，又有該地區(qū)典型的突變位點，突變位點呈多樣化分布。可能與瀘州位于云、貴、川交界處，交通不發(fā)達、人員流動較少等因素有關(guān)。又由于主要突變譜與粵東潮州、寧波和海南澄邁縣一致，可能與農(nóng)民工進城到沿海務(wù)工子女互通婚姻有關(guān)。

從年齡上分析，<1歲的患兒1024C>T型居首位，比例明顯高于≥1歲以上的的患兒；≥1歲者1388G>A型所占比例明顯高于<1歲的患兒。這種差異提示1024C>T型導致G6PD缺乏癥首次發(fā)病年齡較小，也可能與本研究對象(<1歲的患兒307例，≥1歲的患兒143例)不同或患者提供的病史等有關(guān)，有待進一步研究。從性別上看，男性和女性患兒前2位突變型均為1388G>A(26.7%)、1376G>T(26.2%)，男性患兒1024C>T(25.0%)占第3位，而女性第3位為95A>G (14.0%)。提示突變類型可能與性別有關(guān)，也可能與研究數(shù)量太少有關(guān)，可擴大數(shù)量進一步研究。

貧血、黃疸、尿色改變和肝腫大為該病主要的臨床癥狀，不同基因突變型之間臨床表現(xiàn)沒有明顯差異。215例突變患者中男性酶活性明顯低于女性，各突變型酶活性在同一性別中差異無統(tǒng)計學意義，但同一突變類型中，1388G>A和95A>G突變酶活性波動范圍最大，1376G>T和1024C>T突變酶活性普遍處于低值。基因突變患兒中有24例(男5例，女19例)酶活性檢測正常，其中1388G>A型占12例，比例明顯高于與其他突變類型，可能與Gl388A 是一個比較保守的替換(Arg→His)，對酶活性影響較小有關(guān)[23]。以上這些差異說明基因型與表型之間存在著差異，突變位點不同所造成G6PD酶活性喪失程度波動范圍相同；突變位點相同的G6PD缺乏癥不同個體，酶活性表現(xiàn)也有所差異。另外，檢測中還發(fā)現(xiàn)有38例患兒酶活性降低(女7例，男32例)，未發(fā)現(xiàn)基因突變。說明診斷該病如果只選擇一種方法，會造成漏診,延誤該病的治療。如果經(jīng)費允許可聯(lián)合基因測序，進一步發(fā)現(xiàn)少見的突變型或新型突變基因位點。