張振博 李怡君 陳靖毅 王 順 崔安鳳 向 萌 楊葉虹 張麗紅

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖與組織胚胎學(xué)系,2生理與病理生理學(xué)系 上海 200032;3復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科 上海 200040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD) 是一種以進(jìn)行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。在伴有AD的高血壓患者臨床治療中,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑培哚普利(perindopril)在降低患者血壓的同時(shí)能夠顯著改善認(rèn)知功能[1],但其機(jī)制尚不明確。針對(duì)AD發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說(如基因突變學(xué)說、Aβ毒性學(xué)說、tau蛋白異常修飾學(xué)說、微量元素學(xué)說等),這些學(xué)說從不同的角度解析了AD的發(fā)病及病理過程。近年來的大量研究證實(shí),鋅、鐵、銅等金屬離子與AD的發(fā)病及病理過程密切相關(guān),而應(yīng)用金屬螯合劑可顯著改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能[2-3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的游離鋅離子主要存在于鋅能神經(jīng)元(zinc-enriched neurons,ZEN)的突觸小泡內(nèi),在突觸活動(dòng)過程中,鋅離子和谷氨酸共同釋放到突觸間隙并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入突觸后神經(jīng)元,進(jìn)而激活對(duì)突觸可塑性的形成有重要作用的蛋白[4]。鋅缺乏和鋅過量都可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[4-5],腦鋅穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)于保持認(rèn)知功能的穩(wěn)定性具有重要的生理和病理意義。培哚普利能有效調(diào)節(jié)消化道對(duì)鋅離子的吸收水平[6],提示培哚普利在機(jī)體鋅離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用。但培哚普利作為一種能夠有效穿過血腦屏障的經(jīng)典抗高血壓藥物[7],是否通過調(diào)控腦內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài),尤其是鋅穩(wěn)態(tài),改善AD認(rèn)知功能,尚未見報(bào)道。

為明確培哚普利對(duì)腦內(nèi)金屬離子的調(diào)控作用及其機(jī)制,本研究以APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象,檢測(cè)培哚普利對(duì)小鼠認(rèn)知功能,鋅離子、鐵離子、錳離子、銅離子、鎂離子、鈣離子含量及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zn transporters,ZnTs)家族成員(ZnT1、ZnT2、 ZnT3、ZnT4 、ZnT5、 ZnT6、 ZnT7)mRNA表達(dá)水平的影響,以期為進(jìn)一步明確培哚普利改善AD認(rèn)知功能的機(jī)制研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為AD的藥物治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

材 料 和 方 法

水迷宮實(shí)驗(yàn)應(yīng)用morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(SANS,江蘇賽昂斯生物科技有限公司)連續(xù)測(cè)試小鼠6天、每天1次。實(shí)驗(yàn)房間保持黑暗,安靜。每次由4個(gè)試驗(yàn)組成,60 s作為一次試驗(yàn)的時(shí)間。每個(gè)試驗(yàn)過程如下:將小鼠從水池邊緣的4個(gè)不同象限(東、南、西、北)面向水池壁放入,讓其在具有隱藏平臺(tái)的水池中自由游泳60 s,直到找到平臺(tái),并在平臺(tái)上停留3 s,記作其逃避潛伏期;如果找不到平臺(tái),引導(dǎo)其在平臺(tái)上停留10 s,將逃避潛伏期記作60 s。第6天將平臺(tái)撤掉,將小鼠依次從東、南、西、北4個(gè)象限放入水池,自由泳60 s,視頻設(shè)備記錄其穿越平臺(tái)次數(shù)。

電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測(cè)小鼠連續(xù)灌胃3個(gè)月后,腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉后,斷頭處死,迅速取大腦皮層組織。取組織前準(zhǔn)備足量0.5 mL的離心管并使用分析天平稱量其重量,精確至小數(shù)點(diǎn)后4位,記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)后取每只小鼠大腦皮層組織50～100 mg置于相應(yīng)離心管內(nèi),稱取總重量,同樣精確至小數(shù)點(diǎn)后4位;用200 μL槍頭將離心管內(nèi)的組織轉(zhuǎn)移至消解罐,同時(shí)分別加200 μL濃硝酸至離心管內(nèi),沖洗內(nèi)壁后分別轉(zhuǎn)移至相應(yīng)消解罐中,記錄消解罐對(duì)應(yīng)樣本的順序,將消解罐按照順序放入消解儀中,啟動(dòng)消解程序,消解完成后使用超純水將內(nèi)塞上的消解液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的消解罐內(nèi),將消解罐按順序放入趕酸儀中,120 ℃ 3～4 h,將液體層轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的離心管中,定容至相同體積后上機(jī)做電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)檢測(cè)(iCAP tm RQ ICP-MS,美國(guó)Thermo Fisher公司)。

real-time PCRTrizol法提取小鼠大腦皮層組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,real-time PCR檢測(cè)小鼠大腦皮層組織中ZnT1、ZnT2、 ZnT3、ZnT4 、ZnT5、 ZnT6和 ZnT7的mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,循環(huán)40次,引物序列見表1。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用GraphPad Prism7軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,兩組之間使用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

培哚普利改善AD模型小鼠認(rèn)知功能兩組小鼠連續(xù)灌胃3個(gè)月后,進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),統(tǒng)計(jì)軟件分析各組小鼠的逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)及游泳總距離。結(jié)果顯示,與對(duì)照組AD小鼠相比,培哚普利組小鼠在第1、2、5、6天的逃避潛伏期分別降低35.8%、34.1%、46.7%和61.2%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002 3,0.012 7,0.002 6和0.000 7)(圖1A);培哚普利組小鼠第6天的逃避潛伏期相比第1天降低54.4%(P<0.000 1),而對(duì)照組小鼠第6天的逃避潛伏期相比第1天僅降低24.5%(P<0.000 1);與對(duì)照組AD小鼠相比,培哚普利組小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)由0升至1,且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1,圖1B);對(duì)照組和培哚普利組小鼠游泳總距離分別是532和829 cm,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。

表1 基因及其對(duì)應(yīng)的引物序列Tab 1 Gene and the primer sequence

A:Escape latency;B:Number of platform crossings on the sixth day;C:Total swimming distance.In each group,n=5.(1)P<0.001,(2)P<0.005,(3)P<0.001.ND:Not detected.

圖1 水迷宮檢測(cè)培哚普利對(duì)APP/PS1小鼠認(rèn)知功能的影響
Fig 1 Effect of perindopril on cognitive function of APP/PS1 mice by morris water maze test

培哚普利對(duì)小鼠大腦皮層中金屬微量元素含量的影響兩組小鼠進(jìn)續(xù)灌胃3個(gè)月后取大腦皮層,應(yīng)用ICP-MS技術(shù)檢測(cè)鋅、鐵、錳、鎂、鈣、銅元素含量的變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組小鼠相比,培哚普利組小鼠大腦皮層中鋅離子含量升高27% (P=0.004 2),而培哚普利與對(duì)照組小鼠大腦皮層的鐵、錳、鎂、鈣、銅元素含量未見顯著性差異(圖2)。

The contents of zinc ion in perindopril group was increased by 27%(P=0.0042).There was no significant difference in the contents of iron ion,manganese ion,magnesium ion,calcium ion or copper ion between the two groups (n=5).

圖2 ICP-MS檢測(cè)培哚普利對(duì)APP/PS1小鼠大腦皮層
中金屬微量元素含量的影響
Fig 2 Effects of perindopril on the contents of metal elementsin cerebral cortex of APP/PS1 transgenicmouse detected by ICP-MS

培哚普利對(duì)小鼠大腦皮層中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)的影響real-time PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組小鼠相比,培哚普利組小鼠大腦皮層中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnT1的表達(dá)降低38%(P=0.002 2)。培哚普利組與對(duì)照組小鼠相比,大腦皮層中ZnT2、ZnT3、ZnT4、ZnT5、ZnT6、ZnT7的mRNA表達(dá)未見顯著性差異(圖3)。

討 論

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是嚴(yán)重影響老年人健康的神經(jīng)退行性疾病,隨著我國(guó)人口的日益老齡化,AD的發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)[8-9]。由于目前缺乏有效的治療手段,尋找AD治療的新靶點(diǎn)及相關(guān)藥物具有重要的臨床和社會(huì)意義。

AD的典型病理特征為腦內(nèi)Aβ老年斑的形成,然而,以Aβ作為AD治療靶點(diǎn)的多項(xiàng)藥物開發(fā)與臨床試驗(yàn)均未能有效改善AD的認(rèn)知功能[10-11],Aβ老年斑的形成是導(dǎo)致認(rèn)知損傷的原因抑或是機(jī)體反應(yīng)性保護(hù)的結(jié)果,尚有待進(jìn)一步深入探討[11-12]。因此,AD治療新靶點(diǎn)是目前改善AD認(rèn)知功能治療的重要方向之一。抗高血壓藥物,特別是鈣通道阻滯劑和腎素-血管緊張素系統(tǒng)阻滯劑(如培哚普利),有助于預(yù)防認(rèn)知功能減退和癡呆[13],能夠減輕東莨菪堿所致的記憶缺陷,并表現(xiàn)出增強(qiáng)記憶的作用[14]。培哚普利與依達(dá)帕胺聯(lián)合治療12個(gè)月可改善動(dòng)脈高壓患者的內(nèi)皮細(xì)胞功能、微循環(huán)結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)以及認(rèn)知功能[15]。培哚普利和替莫酚通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)調(diào)節(jié)因子、神經(jīng)炎癥和氧化亞硝基應(yīng)激,對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙和淀粉樣變有保護(hù)作用[16]。本研究以APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為AD模型小鼠,采用水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí),培哚普利可以顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能,提示血管緊張素類藥物在AD治療中的潛在作用。

The expression of ZnT1 in perindopril group was reduced by 38%.There was no significant difference in the expression of ZnT2,ZnT3,ZnT4,ZnT5,ZnT6,ZnT7 between the two groups (n=5).

圖3 real-time PCR檢測(cè)培哚普利對(duì)APP/PS1小鼠
大腦皮層中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)的影響
Fig 3 Effect of perindopril on the expression ofzinc transporter mRNA in cortex of APP/PS1mice by real-time PCR

微量元素水平與AD的病理發(fā)生過程密切相關(guān),AD患者腦內(nèi)鋅、鐵、銅等離子含量升高,同時(shí)伴隨著血液和腦脊液中部分離子水平下降[17-19]。我們前期的研究結(jié)果證實(shí),鋅在AD患者尸檢腦組織及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織的Aβ斑塊中高度富集[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn),APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在應(yīng)用培哚普利3個(gè)月后,大腦皮層的鋅離子含量顯著增加,證實(shí)了培哚普利對(duì)腦鋅代謝的調(diào)控作用。基于培哚普利對(duì)認(rèn)知功能的改善作用,我們推測(cè)促進(jìn)鋅離子在大腦皮層內(nèi)的聚集可能是培哚普利改善AD認(rèn)知的重要機(jī)制之一,調(diào)控鋅離子穩(wěn)態(tài)可能成為AD治療的重要途徑。

然而,鋅離子不能自由通過細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜,ZnTs、金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)和ZIP家族是調(diào)控機(jī)體鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)的3個(gè)重要蛋白家族[4,23]。ZnT家族成員的主要作用是將鋅運(yùn)出細(xì)胞或隱藏在細(xì)胞器內(nèi),以降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鋅離子濃度。ZnT1是ZnT家族中最先被發(fā)現(xiàn)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體,也是ZnT家族中唯一定位在細(xì)胞膜上的成員,其功能是將鋅離子外排出細(xì)胞,從而維持細(xì)胞內(nèi)外鋅水平的穩(wěn)定。ZnT3定位在突觸小泡膜上,其功能是將鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸小泡內(nèi),使鋅離子聚集在突觸小泡內(nèi)并在突觸活動(dòng)時(shí)釋放到突觸間隙。ZnT家族的其他成員主要定位在細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器膜上,通過向細(xì)胞器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子而降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鋅離子濃度。已有多項(xiàng)研究證實(shí),AD患者及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)存在ZnTs表達(dá)的變化[24-26]。為進(jìn)一步明確培哚普利調(diào)控腦鋅代謝的機(jī)制,我們檢測(cè)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層ZnTs的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZnT1作為唯一定位在細(xì)胞膜上的ZnTs家族成員,其mRNA表達(dá)顯著下降,證明培哚普利可通過調(diào)控ZnT1的表達(dá)水平,進(jìn)而影響鋅離子的分布、改善AD的認(rèn)知水平。

綜上所述,培哚普利可以通過下調(diào)大腦皮層ZnT1表達(dá),調(diào)控腦鋅代謝,進(jìn)而改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能,提示調(diào)控腦內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)是培哚普利改善AD認(rèn)知水平的重要機(jī)制之一。