葉 楠 龔 輝 王 昕

(復旦大學附屬金山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 201508)

心血管疾病是目前世界范圍內(nèi)威脅人類健康、導致人類死亡的第一大疾病,嚴重影響我國居民健康[1-2]。血管內(nèi)皮損傷與功能障礙是心血管事件鏈上最重要的病理機制,與高血壓、冠心病等嚴重危害人類健康的心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及其危險因素互為因果,彼此促進[3]。血管內(nèi)皮能夠合成、釋放多種生物活性物質,其中一氧化氮(nitric oxide,NO)由左旋精氨酸在內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的催化下合成,具有舒張血管、保護血管內(nèi)皮、抗炎抗氧化及阻止血栓形成等作用[4]。eNOS是一氧化氮合酶同工酶中的一種亞型,在血管內(nèi)皮細胞中特異性表達,其生物學活性在被磷酸化后顯著增強,從而促進內(nèi)皮細胞產(chǎn)生并釋放NO[5]。eNOS/NO信號通路在調(diào)節(jié)和維持血管內(nèi)皮功能方面發(fā)揮重要的作用,eNOS活性降低和NO生成減少均可引起血管內(nèi)皮功能障礙[6-7]。

非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)是指不編碼蛋白質的RNA,包括rRNA、tRNA、snRNA、microRNA 等多種已知功能和未知功能的RNA。眾所周知,人類基因組中可轉錄的部分超過90%,但其中僅有不足2%的部分編碼為蛋白質[8-10]。通常認為,ncRNA不翻譯為蛋白質,在RNA 水平即能行使其生物學功能。其中,長度超過200個堿基的ncRNA分子占大多數(shù),被稱為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA);它能夠和DNA、RNA或蛋白質結合,在多個層面實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控[11]。LncRNA廣泛參與機體的生理和病理過程,與各心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[12-13]。近年來,多項研究報道揭示了LncRNA與心血管疾病發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系[14-15]。我們歸納了其中可能與血管內(nèi)皮損傷相關的LncRNA,概況見表1。

表1 相關LncRNA的生物學功能及其病理意義Tab 1 Biological function and pathological significance of related LncRNA

EC:Endothelial cells;I/R:Ischemia/reperfusion;VSMC:Vascular smooth muscle cell;AS:Atherosclerosis.

然而,LncRNA在血管內(nèi)皮細胞eNOS/NO信號通路中的作用仍不明確。僅有個別研究指出,LncRNA-uc001pwg.1可以在由人誘導多能干細胞分化而來的內(nèi)皮細胞中上調(diào)eNOS/NO通路[27];STEEL(splicedtranscriptendothelial-enriched lncRNA)與LEENE(lncRNA that enhances eNOS expression)能夠上調(diào)eNOS的表達[28-29]。因此,本研究結合既往發(fā)現(xiàn)并以此為基礎,尋找并驗證心血管疾病相關LncRNA中調(diào)控eNOS/NO的分子,為今后以eNOS/NO為靶點進一步探究防治心血管疾病的新策略提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

主要材料小鼠主動脈內(nèi)皮細胞(mouse aorta endothelial cells,MAECs)購于江蘇齊氏生物科技有限公司;內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基(endothelial cell medium,ECM)購于美國ScienCell公司;OptiMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;生物基質膠(BD356234 Matrigel)購于美國Corning公司;Trizol試劑、逆轉錄試劑(RrimeScript RT Master Mix)、PCR試劑(SYBR Premix Ex Taq)購于日本Takara公司;PCR相關引物由上海生工生物工程股份有限公司構建并完成測序;eNOS與p-eNOS單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司;GAPDH內(nèi)參抗體以及二抗購于美國Proteintech公司;RIPA裂解液、細胞與組織裂解液(NO檢測用,S3090)、總NO檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

慢病毒質粒構建慢病毒質粒由上海吉滿生物科技有限公司構建,并完成測序、PCR驗證與滴度測定。慢病毒作為載體攜帶有包括:空白質粒(Negative control,NC)、LncRNA-Beta2.7過表達質粒(LncRNA-Beta2.7)、LincRNA-p21干擾質粒(shLincRNA-p21)、LncRNA-ANRIL干擾質粒(shLncRNA-ANRIL)和LncRNA-H19過表達質粒(LncRNA-H19)。其中,空白質粒、LincRNA-p21干擾質粒與LncRNA-ANRIL干擾質粒攜帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和嘌呤霉素抗性基因;LncRNA-Beta2.7過表達質粒和LncRNA-H19過表達質粒攜帶有嘌呤霉素抗性基因。

細胞培養(yǎng)與穩(wěn)定感染MAECs由含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細胞生長補充劑和1%青/鏈霉素雙抗的ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中,待細胞融合度達到80%～90%時按1∶3進行傳代,取第3～7代細胞用于后續(xù)實驗。取部分第3代細胞在細胞融合度達到30%～40%時,將培養(yǎng)基置換為預先混勻有攜帶相應基因序列的慢病毒原液的新鮮培養(yǎng)基,48 h后換液;再經(jīng)24 h后傳代,并在培養(yǎng)基中加入2 ng/mL的嘌呤霉素進行細胞篩選,從而構建穩(wěn)定感染的細胞株。

熒光定量PCRTrizol法提取內(nèi)皮細胞總RNA,測定樣品濃度與純度后應用RrimeScript RT Master Mix (配成反應體系逆轉錄總RNA為cDNA,反應條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。得到cDNA樣品經(jīng)適當稀釋后(1∶3)應用SYBR Premix Ex Taq 配成RCP體系,上機。eNOS上游引物:5’-CAGTGTCCAACATGCTGCTGGAAATTG-3’,下游引物:5’-TAAAGGTCTTCTTCCTGGTGATG-CC-3’;GAPDH上游引物:5’-TGAAGGTCGGTG-TGAACGGATT-3’,下游引物:5’-CGTGAGTGG-AGTCATACTGGAACA-3’。擴增條件為:第一階段:95 ℃ 30 s;第二階段:95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,共40個循環(huán)。eNOS mRNA的表達水平以GAPDH為內(nèi)參進行標準化,以2-△△CT值進行統(tǒng)計分析。

Western blotRIPA裂解液(添加1∶100 PMSF、1∶100 PI)提取細胞總蛋白,取上清加入上樣緩沖液煮沸變性。得到總蛋白樣品經(jīng)BCA測定濃度后取10 μg經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,70 V恒壓濕轉至PVDF膜。而后使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,一抗(eNOS:1∶2 000;p-eNOS:1∶1 000;GAPDH:1∶5 000) 4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育45～60 min后曝光顯色。目的蛋白的表達水平以GAPDH為內(nèi)參進行標準化。

間接法檢測NO收集細胞培養(yǎng)液上清,每組60 μL;S3090裂解液裂解細胞所得樣品,每組取20 μL經(jīng)1∶3稀釋。按照總NO檢測試劑盒說明書的流程,采用還原比色法檢測NO的含量。

劃痕實驗取6孔板,預先在背面用馬克筆做好標記。完成慢病毒穩(wěn)定轉染的MAECs,取對數(shù)生長狀態(tài)的細胞,再次傳代并將細胞鋪板。在細胞密度達到80%～90%時,使用200 μL無菌槍頭在各孔底面劃出豎直且平行的劃痕。穩(wěn)定培養(yǎng)2 h (作為0 h),之后每隔12 h在倒置顯微鏡下觀察一次。參考馬克筆所做的標記于固定位置觀察,并拍照記錄。

小管形成實驗預先在冰浴條件下,于96孔板中均勻加入用OptiMEM培養(yǎng)基1∶1稀釋的生物基質膠(BD Matrigel) 100 μL,37 ℃孵育30 min。完成慢病毒穩(wěn)定轉染的MAECs,取對數(shù)生長狀態(tài)的細胞。終止消化后稀釋為1×105個/mL的細胞懸液,取100 μL覆蓋于基質膠表面,放入細胞培養(yǎng)箱孵育。3 h后在Olympus BX43倒置熒光顯微鏡下觀察,并拍照記錄。應用Image J Angiogenesis analyzer軟件對所得圖像進行分析,采用小管數(shù)目(Nb branches)、小管總長度(Tot.length)、分支點數(shù)(Nb Junctions)作為量化指標。

結 果

穩(wěn)定轉染小鼠主動脈內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)小鼠主動脈內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)良好,呈不規(guī)則的梭形。通過嘌呤霉素篩選、傳代后,在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到細胞內(nèi)GFP表達率高,病毒轉染效率可達90%以上。熒光定量PCR的結果顯示:與對照組相比,LncRNA-Beta2.7過表達組LncRNA-Beta2.7的表達顯著升高(P=0.047),LincRNA-p21敲低組LincRNA-p21的表達顯著降低(P=0.032),LncRNA-ANRIL敲低組LncRNA-ANRIL的表達顯著降低(P=0.009),LncRNA-H19過表達組LncRNA-H19的表達顯著升高(P=0.029),差異均具有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 穩(wěn)定轉染小鼠主動脈內(nèi)皮細胞及其
LncRNA過表達/敲低效率
Fig 1 Stably transfected MAECs and the LncRNAoverexpression/knockdown efficiency

LncRNA對內(nèi)皮細胞eNOS mRNA表達的影響熒光定量PCR的結果顯示:與空白組相比,陰性對照組、LincRNA-p21敲低組、LncRNA-ANRIL敲低組的eNOS mRNA的表達水平無明顯改變;LncRNA-Beta2.7過表達組eNOS mRNA表達顯著升高(P=0.002),差異具有統(tǒng)計學意義;LncRNA-H19過表達組的eNOS mRNA表達下降(P=0.007),差異具有統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2 小鼠主動脈內(nèi)皮細胞eNOS mRNA的表達水平
Fig 2 The mRNA expression of eNOS in MAECs

LncRNA對內(nèi)皮細胞eNOS/p-eNOS蛋白表達的影響Western blot結果顯示:與空白組相比,陰性對照組、LincRNA-p21敲低組、LncRNA-ANRIL敲低組、LncRNA-H19過表達組的eNOS蛋白的表達水平無明顯改變,而LncRNA-Beta2.7過表達組eNOS 蛋白的表達顯著升高(P=0.036);另外,與空白組相比,陰性對照組、LncRNA-Beta2.7過表達組、LncRNA-ANRIL敲低組、LncRNA-H19過表達組的p-eNOS/eNOS比值無明顯改變,而LincRNA-p21敲低組的p-eNOS/eNOS比值則顯著升高(P=0.008)(圖3)。

LncRNA對內(nèi)皮細胞內(nèi)NO含量及其分泌水平的影響各組內(nèi)皮細胞內(nèi)的NO水平均無明顯差異;而與空白組相比,LncRNA-Beta2.7過表達組中培養(yǎng)基上清液中的NO水平則有顯著升高(P=0.019),差異具有統(tǒng)計學意義(圖4)。

LncRNA-Beta2.7對內(nèi)皮細胞遷移與血管形成能力的影響劃痕實驗結果顯示:相比于對照組,LncRNA-Beta2.7過表達組的MAECs傷口愈合速率在12 h和24 h都有顯著提高(P均<0.001);小管形成實驗的結果顯示:相比于對照組,LncRNA-Beta2.7過表達組的MAECs在單位視野內(nèi)形成的小管分支數(shù)無明顯改變(P=0.970),而在小管的總長度和分支點數(shù)上顯著升高(P=0.009,P=0.020)(圖5)。

圖3 小鼠主動脈內(nèi)皮細胞eNOS、p-eNOS蛋白的表達水平
Fig 3 The protein expression of eNOS and p-eNOS in MAECs

圖4 小鼠主動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)NO含量以及NO的分泌水平
Fig 4 The NO production and secretion in MAECs

圖5 劃痕實驗和小管形成實驗
Fig 5 Wound healing assay and tube formation assay

討 論

本研究結合既往發(fā)現(xiàn)并以此為基礎,篩選動脈粥樣硬化相關的LncRNA。在獲得可靠的LncRNA全長序列后,結合慢病毒構建可行性,構建了相應LncRNA的干擾與過表達載體。未能獲得可靠的Tie-1-AS全長序列,MALAT1全長序列過長無法插入質粒等原因使得我們無法考察其對內(nèi)皮細胞eNOS表達的影響?；趧屿o脈不同的生理組成,為了使細胞實驗更接近體內(nèi)的生理病理狀態(tài),本研究選用了原代的MAECs。

本研究首先發(fā)現(xiàn)LncRNA-Beta2.7能夠上調(diào)內(nèi)皮細胞eNOS/NO信號通路。通過慢病毒穩(wěn)定轉染實現(xiàn)的過表達LncRNA-Beta2.7上調(diào)了eNOS mRNA與蛋白的表達,且同步上調(diào)eNOS的磷酸化,使得p-eNOS/eNOS比值保持不變,從而上調(diào)NO的產(chǎn)量。既往研究表明,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的許多生物學功能依賴于eNOS的活性被激活[30],包括誘導血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、分化和血管形成等[31-32]。為了進一步驗證LncRNA-Beta2.7上調(diào)eNOS/NO通路在內(nèi)皮細胞中發(fā)揮的作用,我們使用穩(wěn)定過表達LncRNA-Beta2.7的內(nèi)皮細胞進行功能學實驗,包括劃痕實驗與小管形成實驗。發(fā)現(xiàn)過表達LncRNA-Beta2.7上調(diào)了內(nèi)皮細胞劃痕愈合速率和小管形成水平,表明LncRNA-Beta2.7能夠影響內(nèi)皮細胞的遷移與血管形成能力,這與其對eNOS/NO信號通路的調(diào)控作用相符合。而在既往研究中有學者發(fā)現(xiàn)LncRNA-Beta2.7可以幫助內(nèi)皮細胞抵御缺血再灌注損傷,是一種保護性分子[17,33],與本研究結果基本一致。

除此之外,我們還發(fā)現(xiàn)了敲低LincRNA-p21在不影響eNOS mRNA和蛋白表達水平的情況下,能夠上調(diào)eNOS的磷酸化水平,這與既往研究中LincRNA-p21促進細胞凋亡、抑制細胞增殖的表現(xiàn)相符合[22,34]。但在后續(xù)實驗中,敲低LincRNA-p21上調(diào)NO分泌水平的表現(xiàn)卻并不穩(wěn)定,缺乏統(tǒng)計學意義。既往研究指出LncRNA-H19能夠促進血管平滑肌細胞增殖,引起血管重構[20-21],而我們發(fā)現(xiàn)過表達LncRNA-H19能夠下調(diào)內(nèi)皮細胞內(nèi)eNOS的mRNA水平,但在后續(xù)實驗中LncRNA-H19并沒有影響eNOS蛋白的表達、磷酸化以及NO的含量。我們推測這可能是由于在生理狀態(tài)即非病理模型中改變LncRNA的表達水平對eNOS/NO的調(diào)控作用有限。在本研究中,LncRNA-ANRIL對內(nèi)皮細胞eNOS的表達、NO的含量及其分泌水平?jīng)]有產(chǎn)生顯著的影響。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了LncRNA-Beta2.7在內(nèi)皮細胞可以上調(diào)eNOS/NO的表達以及內(nèi)皮細胞的遷移和血管形成能力。這提示了LncRNA-Beta2.7可能起到保護血管內(nèi)皮、阻止動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的的作用,為今后進一步探究如何保護內(nèi)皮功能障礙,防治心血管疾病提供了新的思路和實驗依據(jù)。此外,LncRNA-Beta2.7如何實現(xiàn)對eNOS的表達及其磷酸化的調(diào)控,是否還有其他靶基因參與了血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié),均值得進一步研究和探討。