談志麗 王迎迎 何 玉 鐘 歡 施青青 楊 雪 徐國(guó)榮 劉亮明

(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院感染科 上海 201600)

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞之一,在機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用,其表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)如Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)可被外來病原體或內(nèi)毒素激活,啟動(dòng)炎癥信號(hào)通路,促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌[如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6和IL-1β等],產(chǎn)生損傷性炎癥反應(yīng)[1]。IL-1受體相關(guān)激酶1結(jié)合蛋白1(IL-1 receptor associated kinase 1 binding protein 1,Irak1bp1)的編碼基因位于6q14.1,全長(zhǎng)79 356 bp[2],是Irak1蛋白質(zhì)的結(jié)合蛋白。Irak1蛋白質(zhì)在TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴的信號(hào)通路中,被接頭蛋白MyD88磷酸化后激活TNF受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)并使之泛素化,泛素化的TRAF6分子招募轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活化激酶 1(TGF-β activated kinase-1,TAK1),TAK1 能夠磷酸化激活I(lǐng)kB蛋白激酶(IkB kinase,IKK),進(jìn)而促進(jìn)NF-κB釋放入核,激活NF-κB炎癥通路[3]。目前研究表明Irak1bp1蛋白質(zhì)與炎癥關(guān)系密切,但是對(duì)于炎癥反應(yīng)的具體調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制仍存在不同的觀點(diǎn)[4-5],Conner等[6]研究發(fā)現(xiàn)Irak1bp1能夠抑制IL-6分泌而促進(jìn)IL-10分泌,發(fā)揮抑炎作用;而Benson等[7]卻發(fā)現(xiàn)Irak1bp1能夠促進(jìn)IL-6及IL-8分泌。為進(jìn)一步了解Irak1bp1蛋白質(zhì)與炎癥反應(yīng)的關(guān)系,本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠Raw 264.7細(xì)胞,研究核內(nèi)外Irak1bp1蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

材 料 和 方 法

主要試劑和材料單核細(xì)胞系Raw 264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;PCR相關(guān)試劑購(gòu)自日本Takara公司;ELISA相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司;Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Irak1bp1兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;β-actin及Lamin B1兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

細(xì)胞培養(yǎng)采用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含90% RPMI 1640培養(yǎng)液、10% FBS和100 U/mL青鏈霉素混合液),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠Raw 264.7細(xì)胞。采用錐蟲藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力。

細(xì)胞分組和處理細(xì)胞接種于6孔板,每孔細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)。培養(yǎng)24 h待其穩(wěn)定貼壁后,將細(xì)胞隨機(jī)分成2組:A組為正常對(duì)照組,B組為L(zhǎng)PS刺激組。LPS以RPMI 1640培養(yǎng)液配置,終濃度為20 μg/mL,劑量及用法見參考文獻(xiàn)[8],于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。LPS刺激6 h后分別收集細(xì)胞和上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

總RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè)采用Trizol試劑提取總RNA,具體操作按照說明書進(jìn)行。采用吸光度比值(D260/280)及瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度及完整性:純度良好(1.8～2.0)、RNA條帶完整(28S和18S條帶明亮清晰,28S的亮度是18S的2倍以上)者進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR取1 μg RNA作為模板用于第一鏈cDNA的合成,具體流程按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。引物的設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成,目的基因和內(nèi)參引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)10 μL、上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL、下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL、50×ROX參比染料Ⅱ 0.4 μL、DNA 模板2 μL、dH2O(滅菌蒸餾水) 6.8 μL。采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增,第1步:95 ℃、30 s,1個(gè)循環(huán);第2步:95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 基因擴(kuò)增引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab 1 Primer sequences and product length of gene amplication

ELISA檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞上清液中 IL-6的水平,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。每份標(biāo)本設(shè)2個(gè)復(fù)孔,取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

Western blot檢測(cè)按照Western blot及IP裂解液說明書進(jìn)行總蛋白提取,漿蛋白及核蛋白提取按照碧云天核蛋白和漿蛋白抽提試劑盒說明書進(jìn)行。采用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度,變性、分裝后于-70 ℃凍存。取30 μg總蛋白、漿蛋白及核蛋白進(jìn)行10 % SDS-PAGE,電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜,室溫牛奶封閉2 h,兔抗鼠一抗(1∶1 000稀釋) 4 ℃過夜,TBST漂洗,加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,室溫反應(yīng)1 h。 漂洗后置于顯色液中顯色,通過伯樂分子成像系統(tǒng)成像并觀察,采用image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

結(jié) 果

LPS促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)A、B組Raw 264.7細(xì)胞IL-6 mRNA相對(duì)水平分別為1.00±0.06(n=6)和8.13±0.50(n=6),B組較A組顯著升高(P<0.01,圖1),提示LPS促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)。

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖1 LPS刺激的Raw 264.7細(xì)胞IL-6 mRNA相對(duì)水平
Fig 1 Relative level of IL-6 mRNA in Raw 264.7cells stimulated by LPS

LPS促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞IL-6 蛋白質(zhì)表達(dá)B組IL-6 蛋白質(zhì)相對(duì)水平較A組顯著升高(444.89±103.43vs.162.08±51.78,P<0.01),提示LPS能夠促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞IL-6 蛋白質(zhì)表達(dá)(圖2)。

LPS促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞Irak1bp1 mRNA表達(dá)B組Irak1bp1 mRNA 相對(duì)水平較A組升高(1.21±0.10vs.1.00±0.06,P<0.01),提示LPS促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞Irak1bp1 mRNA的表達(dá)(圖3)。

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖2 LPS刺激的Raw 264.7細(xì)胞上清IL-6蛋白質(zhì)相對(duì)水平
Fig 2 Relative level of IL-6 protein in the supernatant ofRaw 264.7 cells stimulated by LPS

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖3 LPS刺激的Raw 264.7細(xì)胞Irak1bp1 mRNA相對(duì)水平
Fig 3 Relatvie level of Irak1bp1 mRNA in Raw 264.7cells stimulated by LPS

LPS促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞Irak1bp1蛋白質(zhì)表達(dá)B組Irak1bp1總蛋白水平較A組顯著增高(1.36±0.20vs.1.00±0.00,P<0.05),提示LPS促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞Irak1bp1總蛋白的表達(dá)(圖4)。

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖4 LPS刺激的Raw 264.7細(xì)胞Irak1bp1總蛋白相對(duì)水平
Fig 4 Relative level of total Irak1bp1 protein inRaw 264.7 cells stimulated by LPS

LPS單獨(dú)處理不影響胞質(zhì)內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)表達(dá)B組Raw 264.7細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)相對(duì)水平與A組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.12±0.27vs.1.00±0.00),提示 LPS單獨(dú)處理并不影響胞質(zhì)內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)表達(dá)(圖5)。

A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖5 LPS刺激的Raw 264.7細(xì)胞胞質(zhì)Irak1bp1
蛋白質(zhì)相對(duì)水平
Fig 5 The relative level of cytoplasmic Irak1bp1 protein inRaw 264.7 cells stimulated by LPS

LPS促進(jìn)核內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)表達(dá)B組Raw 264.7細(xì)胞Irak1bp1漿蛋白相對(duì)表達(dá)水平較A組顯著增高(1.61±0.45vs.1.00±0.00,P<0.01),提示LPS促進(jìn)核內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)表達(dá)(圖6)。

FigA:Western blot result;Fig B:Relative expression level.A:Control group;B:LPS stimulation group.

圖6 LPS 刺激的Raw 264.7細(xì)胞胞核內(nèi)Irak1bp1
蛋白質(zhì)相對(duì)水平
Fig 6 The relative level of nuclear Irak1bp1 protein inRaw 264.7 cells stimulated by LPS

討 論

作為重要的免疫細(xì)胞之一,巨噬細(xì)胞可以依靠其表面的CD14分子和TLR被LPS激活,進(jìn)而啟動(dòng)MyD88依賴和TRIF依賴的信號(hào)通路[9],誘導(dǎo)促炎因子釋放[10],在急性肝衰竭[11-12]、急性胰腺炎[13]等多種免疫損傷性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

Irak1bp1是Irak1蛋白質(zhì)的結(jié)合蛋白,目前對(duì)于其功能的研究十分缺乏,僅有的研究顯示Irak1bp1與炎癥關(guān)系密切,但是對(duì)于炎癥反應(yīng)的具體調(diào)控作用及機(jī)制仍存在不同的觀點(diǎn)[4-5]。Harrington團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)Irak1bp1能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng),過表達(dá)Irak1bp1能夠促進(jìn)IL-6及IL-8的分泌,而且能夠增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB激活[5,7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Irak1bp1功能發(fā)揮可經(jīng)歷以下步驟:(1)磷酸化 Irak1bp1是Irak1蛋白的結(jié)合蛋白,也是Irak1的磷酸化底物[14],在TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB激活過程中,Irak1首先被TNF-α作用而磷酸化[15],繼而磷酸化Irak1bp1并促使其入核[14]。Irak1催化活性缺失可抑制Irak1bp1入核,也能阻斷TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的激活[14],Irak1bp1的磷酸化是其功能發(fā)揮的首要步驟。(2)核轉(zhuǎn)位Irak1bp1序列中存在與p65、p50等入核基因相似的核定位序列,Irak1bp1磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核,能夠增強(qiáng)NF-κB p65亞基的轉(zhuǎn)錄激活能力,核定位序列缺失將削弱上述作用[16],核轉(zhuǎn)位是Irak1bp1功能發(fā)揮的基礎(chǔ)。(3) p65/MED1/Irak1bp1復(fù)合體形成:MED1是核受體協(xié)同刺激因子,p65/MED1/Irak1bp1復(fù)合體的形成有助于p65轉(zhuǎn)錄激活作用的增強(qiáng)[17]。然而,Conner團(tuán)隊(duì)卻有不同的發(fā)現(xiàn),Irak1bp1在缺失核定位序列時(shí)仍然能夠調(diào)控炎癥反應(yīng),并且主要起抑制炎癥的作用,Irak1bp1在胞質(zhì)中與p105結(jié)合,通過某種途徑(目前尚不明確)促使NF-κB抑制性亞基p50/p50入核比例增高[4],p50及其前體蛋白p105又稱NF-κB1,屬于NF-кB家族成員,具有DNA結(jié)合的能力,但無基因轉(zhuǎn)錄激活能力[18-19]。p50/p50入核增多,與P65/P50競(jìng)爭(zhēng)炎癥因子結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)而抑制IL-6分泌及其抑炎作用[4]。

為進(jìn)一步了解Irak1bp1蛋白質(zhì)與炎癥反應(yīng)的關(guān)系,本研究采用LPS刺激Raw 264.7細(xì)胞,并研究Irak1bp1的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞IL-6 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的同時(shí)促進(jìn)Irak1bp1 mRNA的表達(dá),通過Western blot也發(fā)現(xiàn)LPS刺激促進(jìn)Raw 264.7細(xì)胞分泌Irak1bp1蛋白質(zhì),提示Irak1bp1蛋白質(zhì)與TLR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切,這與Conner等[6]的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究顯示LPS主要使核內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)水平增加,而對(duì)胞質(zhì)內(nèi)Irak1bp1蛋白質(zhì)水平?jīng)]有影響,提示LPS能夠促進(jìn)Irak1bp1進(jìn)入細(xì)胞核,多項(xiàng)研究顯示LPS能夠通過激活TLR4-MyD88信號(hào)通路激活I(lǐng)RAK1蛋白質(zhì)[3],這與既往研究結(jié)果類似[14-16],即IRAK1磷酸化Irak1bp1蛋白質(zhì)入核并發(fā)揮作用。Irak1bp1對(duì)于炎癥反應(yīng)具體的調(diào)控作用目前仍不明確,不同研究團(tuán)隊(duì)得出的不同觀點(diǎn)可能與其研究對(duì)象不同、刺激因素及研究的側(cè)重點(diǎn)不同有關(guān),Irak1bp1的炎癥調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。