張青嫻 ，徐引弟 ，王治方 ，郎利敏 ，李海利 ，焦文強 ，朱文豪 ，張立憲 ，游 一 ，許 峰 ，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種人畜共患的腸道細菌性傳染病，是引起1周齡以內(nèi)仔豬死亡的主要原因[1]。

大腸桿菌為條件性致病菌，鑒于其具有明顯且有代表性的耐藥性特征指標，常將大腸桿菌作為抗生素耐藥參考基因庫。頭孢菌素具有廣譜、高效、耐酶等優(yōu)點，通常被用作治療由大腸桿菌引起的感染。然而自2002年以來，在不同國家地區(qū)的食源性動物中檢出了越來越多的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamases,ESBLs）類大腸桿菌。食源性動物中的產(chǎn)ESBLs類大腸桿菌被認為是人群感染耐藥性大腸桿菌的潛在來源[2]。2005年以前中國很少在動物分離物中檢測到產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌，但近年來我國這類大腸桿菌的檢出率在急劇增加，其中blaCTX-M型ESBLs是最常見的類型[3-5]。編碼ESBLs的基因通常位于細菌攜帶的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或者整合子上，還可攜帶其他抗性基因，通過水平傳播參與細菌的多重耐藥。目前已發(fā)現(xiàn)的ESBLs基因主要有blaCTX-M、blaTEM、blaSHV和blaOXA型等[6-11]。

本試驗對2018年分離自河南省部分豬場的大腸桿菌進行了ESBLs表型測定，通過PCR方法檢測blaCTX-M、blaTEM、blaSHV和blaOXA等 ESBLs耐藥基因，旨在調(diào)查河南省豬群產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的分子流行特點，為預防和追溯ESBLs基因的傳播和流行提供理論依據(jù)，為指導臨床耐藥菌株的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 分點采集河南省部分養(yǎng)豬場（戶）豬的糞便或病料樣本，所采集地區(qū)為鄢陵、內(nèi)黃、泌陽、汝陽、鶴壁、武陟、滑縣、濮陽、濟源、方城等10個地市的40多個健康豬群。

1.1.2 主要試劑 LB 肉湯（LB Broth）、LB 瓊脂（LB Agar）、Mueller-Hinton瓊脂、麥康凱（MC）瓊脂、革蘭氏染色液等試劑購自北京奧博星生物公司。Taq PCR master mix、DL 2 000 DNA Marker等 PCR 試劑、DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒等為上海生工生物有限公司產(chǎn)品。標準菌株大腸桿菌ATCC25922購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。頭孢他啶（CAZ）及頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CLA）、頭孢噻肟（CTX）及頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CLA）藥敏紙片購自杭州濱和微生物有限公司。

1.1.3 主要儀器 紫外透射儀、電泳儀（北京六一），PCR擴增儀、生物安全柜（Thermo公司），TK-15臺式高速冷凍離心機（SIGMA公司），氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇中大），超低溫冰箱（REVCO公司），三目生物顯微鏡（Nikon公司），高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.1.4 試驗動物 80日齡昆明小鼠購自鄭州大學動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理 將無菌棉拭子浸泡于含滅菌營養(yǎng)肉湯的試管內(nèi)，通過直腸拭子收集糞便樣品，保存在冰盒里48 h內(nèi)運送到實驗室做進一步處理。部分送檢病料（肺臟、心臟、肝臟等），全部病料共計740份。將肛拭子或病料無菌分區(qū)劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落生長情況，挑取典型菌落劃線轉(zhuǎn)接到伊紅-美藍平板，純培養(yǎng)后染色鏡檢進行形態(tài)學鑒定。將鏡檢疑似大腸桿菌的可疑菌落應用大腸桿菌屬特異性引物進行PCR鑒定。

1.2.2 PCR鑒定 將收集到的直腸拭子無菌接種于MC瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12～24 h后，挑取平皿上玫紅色、不透明、中等大小的單菌落，接種MC瓊脂平皿純化一代以后進行鑒定。分離株經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢和 16S rRNA（Forward：5′-ATGAA AGCTGGCTACAGGAAGGCC-3′，Reverse：5′-GGTTT ATGCAGCAACGAGACGTCA-3′）分析檢測。陽性分離株用終濃度為30.0%甘油肉湯于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠致病性檢測 小白鼠試驗前觀察3 d，確認健康后用于試驗。將待檢已純化的590株大腸桿菌菌株依次接種營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18 h后，細菌計數(shù)后，將菌液稀釋成約1×1010CFU/mL，每個菌株為1組，每組接種3只小白鼠，為試驗組，設(shè)一組對照組。試驗組腹腔接種菌液，0.3 mL/只，對照組腹腔接種相同劑量的滅菌生理鹽水，隔離飼養(yǎng)，觀察小白鼠發(fā)病和致死情況。剖檢死亡小白鼠，無菌取其心臟血做回歸檢測試驗。

1.2.4 ESBLs的耐藥表型測定 根據(jù)美國臨床和實驗室標準委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推薦的雙紙片協(xié)同法，對分離株做ESBLs的初篩試驗。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。將頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸（或頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸）置于接種的Mueller-Hinton瓊脂平板上，間隔20 mm，37℃恒溫培養(yǎng)12～24 h，任意一組或兩組頭孢他啶（CAZ）抑菌環(huán)直徑≤25 mm或頭孢噻肟（CTX）抑菌環(huán)直徑≤27 mm，且含棒酸紙片的抑菌環(huán)直徑大于不加棒酸紙片的抑菌環(huán)5 mm以上，可初步診斷為ESBLs陽性。

1.2.5 ESBLs分離株的基因型測定 參考GenBank上已發(fā)表的ESBLs耐藥基因序列，設(shè)計出4對特異性引物，分別對應blaCTX-M、blaTEM、blaSHV和blaOXA等耐藥基因，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如表1。

將上述ESBLs陽性菌株接種LB平皿，37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h后，挑取單菌落于100 μL滅菌超純水中，制成菌液混懸液，100℃煮沸10 min后12 000 r/min離心10 min，吸取上清作為PCR模板備用。陰性對照為質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922。

表1 基因引物序列及片段長度

PCR 體系終體積為 25 μL，含有 13 μL Taq PCR master mix、上下游引物（20 μmol/L）各 1 μL、5 μL菌液和5 μL ddH2O。PCR在熱循環(huán)儀中進行，循環(huán)條件為：94℃初始變性7 min，進行35個循環(huán)的擴增，94℃變性 30 s，53～56℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，最后在72℃下延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定

菌落在SS培養(yǎng)基上生長形態(tài)為桃紅色、邊緣整齊、稍凸起、表面光滑的圓形菌落，其形態(tài)疑似大腸桿菌。將臨床分離到的細菌在麥康凱瓊脂以及伊紅-美藍瓊脂平板上進行分離培養(yǎng)，挑取大腸桿菌分離株，運用大腸桿菌的特異性引物進行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)均能擴增出大小約為264 bp左右的特異性目的條帶（圖1）。對鑒定正確的細菌送至生物公司進行測序，測序結(jié)果表明分離到的細菌均為大腸桿菌。

圖1 分離的大腸桿菌16S rRNA PCR鑒定

在所有采集到的740份樣本中，共分離到590株大腸桿菌，直腸源405株，器官源185株，總分離率為79.73%，分離純化后放入保存液中-80℃凍存。

2.2 小鼠致病性試驗

將590株ESBLs表型陽性大腸桿菌接種營養(yǎng)肉湯，然后將處理過的營養(yǎng)肉湯接種試驗動物—小白鼠。接種12 h后，590組中有186組試驗組小鼠發(fā)病，對照組小白鼠無明顯變化。發(fā)病小白鼠精神沉郁，采食量大幅減少，呼吸加快，拉稀，體溫升高。357只小白鼠24 h內(nèi)死亡，201只小白鼠48 h內(nèi)死亡，剖檢可見死亡小白鼠肝臟腫大、有出血點和壞死點、心包淤血、腸道膨脹、腸腔充滿水樣稀便，采集試驗組小鼠的心血、肝和脾接種在普通瓊脂平板及普通肉湯，37℃培養(yǎng)20 h后，平板和平皿均有細菌生長，經(jīng)革蘭氏染色及生化鑒定表明此菌與接種細菌為同種細菌，表明該菌對小鼠具有較強的致病力。其余的404組試驗組小白鼠接種12 h后，出現(xiàn)短暫的精神沉郁和采食下降，此后逐漸恢復，最終表現(xiàn)出與對照組一樣的狀態(tài)；飼養(yǎng)7 d后全部存活，剖檢未見明顯病變。通過試驗結(jié)果證明有186組分離病原菌屬于致病性豬大腸桿菌，陽性率為31.52%（186/590）。

2.3 ESBLs表型測定

將186株大腸桿菌做ESBLs表型測定，結(jié)果表明有112株為陽性菌株。

2.4 產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥基因型特征

所篩選出的112株ESBLs表型陽性株通過PCR方法進行基因分型，陽性菌株分別在205 bp、415 bp、713 bp和800 bp處擴增出陽性條帶，分別提示含有blaCTX-M基因、blaOXA基因、blaSHV基因和blaTEM基因，陰性對照質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922未擴增出陽性基因。電泳結(jié)果與設(shè)計相符（圖2）。分型結(jié)果統(tǒng)計如下：攜帶blaCTX-M基因陽性率最高，共102株（占91.07%），其次為blaTEM，共77株（占68.75%）。51株（45.53%）為blaCTX-M基因（205 bp）和blaTEM（800 bp）雙陽性，9株（8.03%）同時攜帶blaCTX-M基因和blaSHV基因（713 bp）陽性，2株（1.78%）同時攜帶blaCTX-M和blaOXA基因（415 bp），28株（25.0%）單獨攜帶blaCTX-M基因，8株（7.14%）單獨攜帶blaTEM基因，僅1株（0.89%）單獨攜帶blaSHV基因，有13株（11.6%）未擴增出上述耐藥基因。耐藥基因擴增情況見表2。

圖2 部分菌株ESBLs PCR結(jié)果

表2 大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因攜帶情況及基因型

3 討論

我國大腸桿菌對抗生素的多重耐藥性從20世紀90年代開始就表現(xiàn)得十分明顯，在過去的20多年里，大腸桿菌對氨芐西林等抗生素耐藥性高達90%以上，對頭孢曲松或頭孢噻肟等第3代頭孢菌素的平均耐藥率由最初的6%上升接近至56.6%[3]。

本試驗對耐藥基因測定結(jié)果表明，blaCTX-M和blaTEM是河南省最流行的ESBLs類型，且以blaCTXM和blaTEM雙陽性為主（45.53%），攜帶blaCTX-M基因的菌株數(shù)占絕大多數(shù)（91.07%），其次多的為blaTEM基因，只有2株攜帶blaOXA基因，與國內(nèi)大多數(shù)學者研究結(jié)果一致。鄭新添等從福建省龍巖市5個規(guī)?；i場周邊水和土壤中分離大腸桿菌ESBLs，其分離率為34.5%，基因型以blaCTX-M型為主，未檢出blaOXA基因[9]。沈莉萍等研究了上海市1997—2010年間的豬源大腸桿菌耐藥性和產(chǎn)ESBLs菌，發(fā)現(xiàn)上海市ESBLs檢出率只有7.54%，其基因型以blaTEM和blaCTX-M型雙陽性為主[10]。李晴等從養(yǎng)殖廢水中分離的50株產(chǎn)ESBLs菌均含有blaCTX-M和blaTEM基因，謝榕等研究顯示河北大腸桿菌ESBLs分離株陽性率74.7%，基因型以blaCTX為主（66.3%），未檢測到blaSHV的存在，陽性率最高的為blaCTX、blaOXA雙陽性[11-12]。張利勃等介紹遼寧省雞產(chǎn)ESBLs大腸桿菌基因型以blaTEM為主（100%），其次為blaCTX-M型（37.5%），未發(fā)現(xiàn)blaSHV型，且以blaTEM、blaCTX-M雙陽性檢出率最高（34.4%）[13]。曲志娜等統(tǒng)計了青島地區(qū)雞源大腸桿菌菌株產(chǎn)ESBLs陽性率為83.13%，blaCTXM型、blaTEM型和blaOXA型ESBLs菌株的檢出率分別為100.00%、99.52%和47.83%，未檢測出blaSHV型ESBLs菌株[14]。曹敏等研究發(fā)現(xiàn)，貴州地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌陽性率為83.54%，以blaTEM基因型為主（90.51%）[15]。Zheng等從2007—2009年期間覆蓋中國大陸所有7個地理區(qū)域的12個省份收集了896種來自食用動物的大腸桿菌分離株，其中14.2%為產(chǎn)ESBLs菌株，12.4%攜帶blaCTX-M型耐藥基因[4]。近年又有報道在健康的中國人群中糞便樣本中分離出含有大量blaCTX-M的大腸桿菌（50.5%）[16]。

Muzaheed等報道了印度南部的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌中blaCTX-M基因的高流行率[17]。法國科研人員在牛、豬和家禽中也存在blaCTX-M基因[18]。Leverstein-van Hall等最近報道荷蘭患者，零售雞肉和家禽共享相同的ESBLs基因、質(zhì)粒和菌株，表明通過食物鏈將ESBLs基因從家禽傳播到人類[19]。

大腸桿菌blaCTX-M和blaTEM耐藥基因型檢出率的大幅增加，與編碼基因的質(zhì)粒高度轉(zhuǎn)移有關(guān)，這可能由于多數(shù)豬場廣泛使用頭孢曲松、頭孢噻肟和頭孢他啶等第3代頭孢菌素[20]。Barlow等報道，blaCTX-M基因被轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒的頻率幾乎是其他幾類β-內(nèi)酰胺酶的10倍[21]。

本研究證實河南豬群大腸桿菌普遍攜帶ESBLs，食源動物所攜帶的ESBLs基因型在人類和獸醫(yī)學中具有明顯相似的流行率。Shiraki等[22]表明blaCTXM-2可能來自牛，隨后通過牛胴體的污染傳播到食物鏈。葡萄牙和巴西等國報道了寵物可能是blaCTXM基因潛在庫[23-24]，這些研究表明迫切需要人類和獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)SBLs表型開展更詳細的長期調(diào)查研究，以期更準確地評估哪些因素可能導致抗性菌株從動物傳播到人類的風險[25]，需要制定出更嚴格的獸醫(yī)抗生素政策，以防止這些菌株在動物和人類中的出現(xiàn)和傳播，從而減少此類細菌的公共衛(wèi)生安全。