晉 瑞，金迎迎，王敏聰，惠文濤，李 毅，李 芳，賈 輝，潘繼元，馬紅兵

1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學影像科，陜西 西安 710004；

2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤放療科，陜西 西安 710004；

3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西 西安 710004

在我國癌癥的發(fā)生率和死亡率逐年增加，從2010年開始癌癥已成為我國人口死亡的主要原因。食管癌的發(fā)生率已躍居我國惡性腫瘤發(fā)病的第3位，死亡率位居第4位[1］。放療是中晚期食管癌患者最主要的治療手段，但是放療抗拒嚴重影響了食管癌的放療效果[2-3］。因此克服食管癌的放療抗拒仍然是治療食管癌的一大挑戰(zhàn)。泛素化在包括癌癥在內的多種生物學過程中具有重要的調節(jié)作用。它通過泛素化酶和去泛素化酶的活動調節(jié)胞內蛋白可逆的翻譯后修飾，從而幾乎控制蛋白質功能的所有方面[4-5］。泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs）是去泛素化酶中最大的一個家族。USP9x是USPs家族的一員，它與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤細胞的放射抗拒相關[6-8］。Peng等[9］的研究顯示，USP9x的表達與食管鱗狀細胞癌的浸潤深度和淋巴結轉移相關，且USP9x高表達與食管鱗狀細胞癌患者較差的生存率有密切聯(lián)系，但目前它對食管癌細胞放射抗拒的作用尚未見報道。本研究利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術在我們建立的放射抗拒食管癌Ec9706-R細胞中沉默USP9x基因，觀察該基因沉默對Ec9706-R細胞放射敏感性的影響，并探討其可能的作用機制，旨在為臨床上降低食管癌的放療抗拒提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

放射抗拒人食管癌Ec9706-R細胞為本實驗室構建[10］，其親本細胞Ec9706為本實驗室保存細胞，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素均購自美國Gibco公司，噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自美國Sigma公司，膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素-碘化丙啶（Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanatepropidium iodide，Annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒和放射免疫沉淀法（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液均購自上海碧云天生物技術有限公司，LipofectamineTM2000轉染試劑、TRIzol試劑盒和反轉錄一鏈cDNA合成試劑盒均購自美國Invitrogen公司，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，抗USP9x兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、抗髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）兔單克隆抗體（1∶800稀釋）和抗核苷酸切除修復交叉互補基因1（excision repair cross-complementing gene 1，ERCC1）抗體（1∶1 000稀釋）均購自美國Cell Signaling Technology公司，抗β-actin兔多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和放射處理

Ec9706-R和Ec9706細胞均用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱。將Ec9706-R細胞隨機分成3組：放射（irradiation，IR）組、IR+對照siRNA組（IR+si-NC組，轉染Control siRNA）和IR+USP9x siRNA組（IR+si-USP9x組，轉染USP9x siRNA），所有組中的細胞均進行放射處理。

使用6 MⅤ-X 射線對細胞進行單次照射，劑量率為300 cGy/min，細胞源距100 cm。使用0、2、4、6或8 Gy的6 MⅤ-X 射線照射各組細胞，進行后續(xù)研究。細胞培養(yǎng)板下方加1 cm的玻璃板，上方覆蓋1.5 cm厚的膠體。

1.3 細胞轉染

將對數(shù)生長期的E c 9 70 6-R 細胞使用胰酶消化后，接種到6 孔板中（每孔1×106個細胞），待細胞融合度達到5 0%左右時，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作，將USP9x siRNA（si-USP9x）和Control siRNA（si-NC）轉染至細胞中，轉染12 h后進行放射處理，放射結束后，將細胞放回到細胞培養(yǎng)箱中，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 MTT檢測

將放射處理過的Ec9706-R細胞用胰酶消化后，按照1×103個/孔的密度接種到96孔板中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育4 h，每孔加入100 μL DMSO充分溶解甲瓚，然后用酶標儀在570 nm波長處測定樣品的吸光度（D）值。細胞活力=（D實驗組-D空白組）/（D對照組-D空白組）×100%。

1.5 Transwell檢測細胞遷移

將放射處理過的Ec9706-R細胞用胰酶消化后，加無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制備成細胞懸液（2.5×105個/mL）。取200 μL細胞懸液加入到Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出小室，用棉簽輕輕將上層中未遷移的細胞擦去，4%多聚甲醛固定后，結晶紫染色15 min。在顯微鏡下每個小室隨機選擇5個視野進行拍照，這些視野中細胞的平均值為該小室遷移細胞的數(shù)目。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡。具體操作如下：Ec9706-R細胞先轉染si-NC或si-USP9x 12 h，使用6 Gy的6 MⅤ-X 射線照射細胞，然后將細胞重新放回到細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用不含EDTA的胰酶將細胞消化，預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）充分洗滌后加入結合緩沖液重懸細胞制備細胞懸液（密度為1×106個/mL）。然后加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和 10 μL PI，避光溫育15 min。最后使用流式細胞儀檢測各樣品中細胞的凋亡率。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

將細胞從培養(yǎng)箱中取出，棄上清液，預冷的無菌PBS洗滌2次后，按照TRIzol說明書操作提取細胞的總RNA。取2 μg抽提的總RNA用反轉錄一鏈cDNA合成試劑盒將其逆轉錄成cDNA。然后按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒操作，加入各試劑進行RTFQ-PCR反應。USP9x基因上游引物5'-TTGCTCCCAGGACCGTGATA-3'，下游引物5'-AGGCGCTTCACCAAACAAAC-3'；Mcl-1上游引物5'-GACTTTTGGCCACCGGC-3'，下游引物5'-CATCCCCAACCCGTCGTAAG-3'；β-actin基因上游引物5'-CTTCGCGGGCGACGAT-3'，下游引物5'-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3'；以β-actin為內參，按照2-△△CT算法計算USP9x和Mcl-1在轉錄水平的相對含量。

1.8 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

使用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白，BCA試劑盒測定所提取蛋白的濃度。將蛋白沸水浴變性后，每孔取等量樣本行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干轉法將分離的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜上。5%脫脂奶粉將膜封閉2 h后，加入稀釋好的一抗，4 ℃搖床過夜溫育；Tris鹽酸-Tween20緩沖液（Tris-buffered saline-Tween 20，TBST）洗膜后用二抗室溫溫育1 h；TBST洗膜3次，加化學發(fā)光試劑將膜均勻覆蓋，用GS-800成像系統(tǒng)掃描圖像；Image J軟件分析條帶的灰度值，以β-actin為內參評估目的蛋白的水平。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)以x±s表示，應用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，組間差異采用單因素方差分析并進行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 放射線照射對放射抗拒食管癌Ec9706-R細胞及其親本細胞Ec9706中USP9x和Mcl-1表達的影響

使用6 Gy的6 MⅤ-X射線對Ec9706-R和Ec9706細胞進行放射處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，RTFQ-PCR和Western blot檢測細胞中USP9x和Mcl-1 mRNA表達和蛋白水平。與不進行放射的對照組細胞相比，放射組2種食管癌細胞中USP9x和Mcl-1 mRNA表達與蛋白水平均上調，且Ec9706-R細胞中兩者mRNA和蛋白增加的更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖 1 放射對Ec9706-R和Ec9706細胞中USP9x和Mcl-1表達的影響Fig. 1 Expression changes of USP9x and Mcl-1 in Ec9706-R and Ec9706 cells treated with or without irradiation

2.2 USP9x siRNA可下調USP9x的表達

對Ec9706-R細胞轉染si-USP9x或si-NC 12 h，用6 Gy的6 MⅤ-X 射線照射后，再培養(yǎng)48 h，RTFQ-PCR和Western blot檢測細胞中USP9x mRNA表達和蛋白水平。與IR組相比，IR+si-USP9x組中USP9x mRNA表達和蛋白水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與IR組相比，IR+si-NC組中USP9x mRNA表達和蛋白水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。

圖 2 USP9x siRNA對放射后USP9x mRNA和蛋白水平的影響Fig. 2 The effect of USP9x siRNA on USP9x mRNA expression and protein level

2.3 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞增殖的影響

MTT檢測3組細胞在不同劑量（0、2、4、6和8 Gy）6 MⅤ-X射線照射后的細胞活力。隨著放射劑量的增加，各組中細胞活力均逐漸降低；在同等劑量的放射條件下，與IR組相比，IR+si-USP9x組中細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與IR組相比，IR+si-NC組中細胞活力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。另外，6 Gy照射后48 h檢測PCNA水平。與IR組相比，IR+si-USP9x組中PCNA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與IR組相比，IR+si-NC組中PCNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖 3 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞增殖的影響Fig. 3 The effect of USP9x downregulation on the proliferation of Ec9706-R cells under irradiation

2.4 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞遷移的影響

6 Gy照射Ec9706-R細胞后利用Transwell檢測細胞遷移情況。與IR組相比，IR+si-USP9x組遷移細胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與IR組相比，IR+si-NC組中遷移細胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4）。

圖 4 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞遷移的影響Fig. 4 The effect of USP9x downregulation on the migration of Ec9706-R cells under irradiation

2.5 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測細胞凋亡。與IR組相比，IR+si-USP9x組中細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與IR組相比，IR+si-NC組中細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖5）。

2.6 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞中DNA修復蛋白表達的影響

Western blot檢測DNA修復相關蛋白ERCC1的水平。與IR組相比，IR+si-USP9x組中ERCC1蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與IR組相比，IR+si-NC組中ERCC1表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖6）。

2.7 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞中Mcl-1表達的影響

RTFQ-PCR和Western blot檢測Mcl-1 mRNA表達和蛋白水平。與IR組相比，IR+si-USP9x組中Mcl-1 mRNA表達和蛋白水平表達均下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與IR組相比，IR+si-NC組中Mcl-1 mRNA表達和蛋白水平表達變化差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖6）。

圖 5 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞凋亡的影響Fig. 5 The effect of USP9x downregulation on the apoptosis of Ec9706-R cells under irradiation

圖 6 USP9x下調對放射后Ec9706-R細胞中ERCC1和Mcl-1表達的影響Fig. 6 The effects of USP9x downregulation on the expressions of ERCC1 and Mcl-1 in Ec9706-R cells under irradiation

3 討 論

雖然放療是治療食管癌的有效方法之一，但是放療抗拒會導致較高的復發(fā)率和較低的生存率。因此，提高食管癌的放療敏感性是食管癌治療的一個重要策略[11］。USP9x在一些血液惡性腫瘤和多種實體瘤中的表達上調，如腦瘤、乳腺癌、前列腺癌等[6］。靶向USP9x在多種腫瘤中具有潛在的治療效果[6，12］。文獻也發(fā)現(xiàn)USP9x能夠介導多種腫瘤的化療和放療抗拒，如腦瘤、淋巴瘤、乳腺癌、腎癌、肺癌、膀胱癌和前列腺癌等[7-8，13-14］。目前的研究發(fā)現(xiàn)USP9x在食管癌中的表達上調[9］，但是其在食管癌放療抗拒中的作用還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)放射線照射后放射抗拒食管癌細胞及其親本細胞中USP9x的表達均上調，而且放射抗拒細胞中其表達上調的更加明顯，這提示USP9x可能與食管癌的放療抗拒密切相關。由于親本細胞Ec9706對放射的敏感性較高[10］，因此我們只在放射抗拒食管癌細胞Ec9706-R中進一步探究USP9x對食管癌細胞放射敏感性的作用和機制。

我們通過siRNA干擾技術下調USP9x的表達，來探究USP9x在食管癌細胞放射抗拒中的作用。MTT結果顯示，下調USP9x的表達，可明顯抑制放射線照射后放射抗拒食管癌細胞的活力。PCNA是一個重要的增殖標志物，通過檢測其水平可以反映食管癌細胞的增殖情況[15］。我們發(fā)現(xiàn)下調USP9x表達，放射線照射后Ec9706-R細胞中PCNA的水平也降低，表明抑制USP9x表達能夠降低放射后食管癌細胞的增殖。Transwell檢測細胞遷移發(fā)現(xiàn)，與IR組相比，IR+si-USP9x組中遷移細胞數(shù)目降低。流式細胞術檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，下調USP9x表達后細胞凋亡增加。此外，下調USP9x表達明顯降低了DNA修復相關蛋白ERCC1的表達。這些結果表明抑制USP9x表達能夠增加放射抗拒食管癌Ec9706-R細胞的放射敏感性。

Mcl-1是Bcl-2家族抗凋亡蛋白中的一員，它在腫瘤細胞中的表達上調，且與放療和化療中的抗拒反應有關[16-17］。Mcl-1在食管癌組織中的表達上調，并且與浸潤深度和淋巴結轉移相關，下調Mcl-1的表達可以增加順鉑誘導的食管癌細胞凋亡[18］。Sugase等[19］的研究發(fā)現(xiàn)，放射線照射后食管癌細胞中Mcl-1的表達增加，抑制Mcl-1信號可以提高食管癌細胞的放射敏感性。本研究結果也顯示，放射線照射后Ec9706-R細胞及其親本細胞中Mcl-1的表達均上調，且Ec9706-R細胞較其親本細胞上調的更加明顯。最近的研究發(fā)現(xiàn)，USP9x能結合在Mcl-1上，并停止Lys48連接的多聚泛素化鏈反應，從而穩(wěn)定Mcl-1表達，促進腫瘤細胞存活[20］。USP9x介導的放療抗拒與Mcl-1的穩(wěn)定性相關[8，13］。因此我們進一步探究了在食管癌細胞中USP9x與Mcl-1的關系。研究結果顯示，下調USP9x的表達明顯降低了Ec9706-R細胞中Mcl-1 mRNA表達和蛋白水平?？傊?，本研究結果表明，抑制USP9x的表達能夠增加人食管癌Ec9706-R細胞的放射敏感性，這可能是通過下調Mcl-1的表達而發(fā)揮作用的，但是具體的作用機制還需進一步探究。無論如何，以USP9x為靶點的研究可望為臨床上逆轉食管癌放療抗拒提供新的思路和方向。