徐淇淇 張亞妮 李欣芮 范卓妍 車會(huì)蓮

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

食物過(guò)敏原在引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的過(guò)程中主要是通過(guò)抗原表位來(lái)實(shí)現(xiàn)的[1]?？乖砦?，又稱為抗原決定簇，是指抗原分子表面上具有特殊結(jié)構(gòu)和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或特異性淋巴細(xì)胞，且能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別的免疫活性區(qū)域[2]。根據(jù)受體結(jié)合細(xì)胞可以將抗原表位分為T(mén)細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。其中，經(jīng)過(guò)抗原呈遞細(xì)胞處理，由主要組織相容性復(fù)合物分子（MHC）呈遞，并被T細(xì)胞表面受體所識(shí)別的稱為T(mén)細(xì)胞表位；而被抗體或B細(xì)胞表面受體直接識(shí)別的即為B細(xì)胞表位[3]。根據(jù)抗原表位結(jié)構(gòu)的連續(xù)性可以分為線性表位和構(gòu)象表位。線性表位，即連續(xù)性表位，通常是由肽鏈上鄰近連續(xù)的氨基酸組成；而構(gòu)象表位，即不連續(xù)性表位，是由空間鄰近，分布在不同肽鏈上或相同肽鏈的不同部位的不連續(xù)的氨基酸組成。線性表位通常屬于T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，而構(gòu)象表位一般都屬于B細(xì)胞表位[4]。因過(guò)敏原進(jìn)入機(jī)體，被抗原呈遞細(xì)胞處理后過(guò)敏原的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，通常會(huì)變成小段連續(xù)的短肽段，而B(niǎo)細(xì)胞可以直接識(shí)別完整的過(guò)敏原。本文研究的IgE線性抗原表位即屬于B細(xì)胞線性表位，通常由8～12個(gè)氨基酸構(gòu)成，且具有溶劑可及性高，可塑性好，親水性強(qiáng)等特點(diǎn)。目前，研究抗原表位的方法主要有合成重疊肽庫(kù)、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、肽段活性鑒定、噬菌體展示技術(shù)、X射線衍射和核磁共振分析等。其中大多數(shù)方法是針對(duì)構(gòu)象表位的研究。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)線性表位的研究方法逐漸成熟，如合成重疊肽庫(kù)，這種方法方便、準(zhǔn)確，且覆蓋了過(guò)敏原的全部一級(jí)序列。

重疊肽庫(kù)合成法中使用的肽庫(kù)主要是指某一長(zhǎng)度短肽的大量集合[5]，可以含蓋過(guò)敏原一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列中該長(zhǎng)度短肽的大部分甚至所有的可能序列[6]。重疊短肽的合成方法通常是有機(jī)合成法，即固相合成肽技術(shù)[7]。將所有合成的與靶過(guò)敏蛋白氨基酸序列相似的短重疊肽段，通過(guò)圓點(diǎn)印跡試驗(yàn)或免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)其與特異性抗體的結(jié)合情況，來(lái)判斷和篩選其線性抗原表位。在這個(gè)試驗(yàn)中必須通過(guò)過(guò)敏患者血清中的抗原特異性IgE抗體與待測(cè)蛋白的結(jié)合能力來(lái)判斷其是否與已知食物過(guò)敏原具有同源性或交叉反應(yīng)性，而且需要大量的樣本提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因?yàn)檠鍖W(xué)篩選的關(guān)鍵就是血清中高濃度的抗原特異性IgE抗體，若抗體濃度過(guò)低，則無(wú)法避免假陰性的結(jié)果。FAO/WHO建議，為了避免出現(xiàn)血清中的交叉抗體，檢測(cè)時(shí)不要選用5名患者以上混合的血清池[8]。血清的數(shù)量也與試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度相關(guān)?？紤]到現(xiàn)實(shí)中獲得大量的人體樣本比較困難，而構(gòu)建動(dòng)物致敏模型獲得致敏動(dòng)物的血清是一個(gè)很好的替代方法。目前有關(guān)致敏動(dòng)物模型與過(guò)敏人群在抗原結(jié)合表位的差異性的研究很少。

本研究通過(guò)合成包含核桃中主要過(guò)敏原Jug r 1一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列的重疊短肽庫(kù)，利用過(guò)敏患者血清和致敏小鼠血清中的特異性IgE抗體對(duì)其進(jìn)行篩選，以確定所識(shí)別的線性抗原表位，比較兩種方法篩選抗原表位的差異性，為確定利用小鼠血清替代人過(guò)敏患者血清篩選抗原表位，研究食物過(guò)敏機(jī)理、食物過(guò)敏的方法診斷等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

主要材料：卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、霍亂毒素（CT）及生物素標(biāo)記的山羊抗人IgE抗體，Sigma公司；生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgE，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠的IgG1及HRP標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgE抗體，Abcam公司；HRP標(biāo)記鏈霉親和素 （Thermo Scientific）、HRP-DAB顯色液試劑盒（KPL）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Tris-base、丙烯酰胺及甘氨酸，Amresco公司。

主要儀器：Thermo Varloskan Flash多功能酶標(biāo) 儀 ，Thermo Scientific；GelDoc-ItTM 凝 膠 成 像儀，美國(guó)UVP公司；DYY-6C-電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 生物信息學(xué)方法分析Jug r 1的線性抗原表位

從 NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）中獲取Jug r 1的氨基酸序列（Accssion：AAB41308，GI：1794252），其一級(jí)序列共含有139個(gè)氨基酸。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAstar Protein，選用Hoop-woods的氨基酸親水性方案、Emin的蛋白表面可及性方案、Kparlus-Schuzl的柔韌性方案以及Jameson-Wolf的抗原指數(shù)方案，對(duì)Jug r 1一級(jí)結(jié)構(gòu)的親水性、表面可及性、柔韌性以及抗原指數(shù)進(jìn)行分析，4個(gè)參數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果的重疊部分為蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中可能的線性抗原表位序列。

1.3 患者血清的獲得及血清中特異性IgE的測(cè)定

為了檢測(cè)核桃過(guò)敏患者血清中特異性IgE抗體與Jug r 1的結(jié)合情況，共招募10名受試者，其中6名為核桃過(guò)敏患者，通過(guò)病史和臨床反應(yīng)確定其對(duì)核桃存在過(guò)敏反應(yīng)?；颊呔唧w信息見(jiàn)表1。剩余4名為非過(guò)敏受試者，作為對(duì)照。采集的血樣于37℃孵育1 h，4 000 g離心10 min，取上清，分裝編號(hào)，置于-80℃保存。

表1 核桃過(guò)敏患者基本信息Table1 Information of walnut-allergic patients

參照參考文獻(xiàn)[9]免疫印跡方法，將4名非過(guò)敏患者的血清混合后作為陰性對(duì)照。將SDSPAGE分離出的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上，在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中要注意避免將膠刮破，且在切膜和剪切濾紙時(shí)均需戴手套，以防止污染膜上蛋白。在轉(zhuǎn)膜前，將NC膜和濾紙?jiān)陔娹D(zhuǎn)緩沖液中浸潤(rùn)。打開(kāi)電轉(zhuǎn)裝置的夾子，使負(fù)極面保持水平，用少量電轉(zhuǎn)液潤(rùn)濕，依此放入濾紙、分離膠、NC膜、濾紙，此過(guò)程中要不斷用電轉(zhuǎn)緩沖液潤(rùn)濕，且每層之間沒(méi)有氣泡，還要保證濾紙與膜、膠對(duì)齊，然后將其放入電泳槽，80 V電壓電轉(zhuǎn)2 h。由于電轉(zhuǎn)過(guò)程會(huì)產(chǎn)熱，所以需冰浴。

電轉(zhuǎn)后將NC膜用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉，室溫下?lián)u動(dòng)封閉1 h。加入一抗（過(guò)敏患者血清，1∶10倍稀釋），4℃過(guò)夜孵育。用TBST洗滌3次，每次5 min。加入二抗（生物素標(biāo)記的山羊抗人IgE抗體1∶2 000稀釋）室溫下孵育1h，TBST洗滌3次，再加入1∶500稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫下孵育1 h，TBST洗滌6次。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光劑孵育5 min，將膜轉(zhuǎn)移到干凈的保鮮膜上，除去殘液，放入X-光片夾中，在X-光片中曝光，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)調(diào)整曝光時(shí)間，通常是30 s或1 min左右。曝光結(jié)束后，取出X膠片，將其浸入顯影液中，當(dāng)出現(xiàn)明顯條帶后將其轉(zhuǎn)移至定影液中，5～10 min后將膠片取出，用自來(lái)水洗去殘液，室溫下晾干。注意整個(gè)顯影和定影的過(guò)程要在暗室進(jìn)行。最后利用凝膠圖像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，觀察顯色條帶是否是在15 ku處（證明存在核桃中主要過(guò)敏原Jug r 1特異性的IgE抗體，且均可與Jug r 1發(fā)生特異性結(jié)合）。

1.4 致敏小鼠血清的獲得及血清中特異性IgE的測(cè)定

為了檢測(cè)致敏小鼠血清中特異性IgE抗體與Jug r 1的結(jié)合情況，用3～4周齡的SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠建立核桃致敏小鼠模型。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前在動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d，自由攝食和飲水（飼料中不含有雞蛋、核桃或堅(jiān)果成分），室內(nèi)溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度（55±5）%。將動(dòng)物按體重隨機(jī)分為3組：致敏組（Jug r 1+CT佐劑）、陽(yáng)性對(duì)照組（OVA+CT佐劑）和陰性對(duì)照組（PBS+CT佐劑）。每組8只小鼠。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6周，每周監(jiān)測(cè)動(dòng)物的體重及生長(zhǎng)情況。采用經(jīng)口灌胃的方法，在試驗(yàn)第0，7，14，21，28 天分別經(jīng)口灌胃給予各組小鼠相應(yīng)的1 mg蛋白溶液 （含有10 μg的CT佐劑），并在第42天進(jìn)行10倍濃度的大劑量刺激，3 000 g條件下離心并分離血清，分裝后保存于-80℃，用ELISA法測(cè)定各組動(dòng)物血液中特異性IgE和IgGl的水平。

將受試蛋白分別用包被緩沖液稀釋至10mg/L，在 96孔板上選擇需要包被的孔，每孔加入包被液100 μL，4℃過(guò)夜。用洗液洗滌3次后，加入封閉液，在37℃下封閉1 h。之后重復(fù)洗滌3次。加入1∶5稀釋的小鼠血清，在37℃下孵育1 h。重復(fù)洗滌3次，每孔加入100 μL 1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgE抗體（或抗IgG1），在37℃下孵育1 h。重復(fù)洗滌6次。每孔加入100 μL TMB顯色液，37℃下顯色15 min后，每孔加入50 μL硫酸終止液，在波長(zhǎng)450 nm處讀取OD值，分析得到各組動(dòng)物血液中特異性IgE和IgGl的含量 （以及癥狀、體溫變化及血漿中組胺的含量），確定成功建立核桃致敏小鼠模型，小鼠血清可用于篩選與其中特異性IgE結(jié)合的肽段。

1.5 Jug r 1重疊肽段的合成及IgE線性表位的確定

為了得到Jug r 1的氨基酸一級(jí)序列，從SDAP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//fermi.utmb.edu/cgi-bin/SDAP/）中獲得Jug r 1的蛋白質(zhì)序列ID。再根據(jù)蛋白質(zhì)序列ID在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）中獲取Jug r 1的氨基酸序列（Accssion：AAB41308；GI：1794252），其一級(jí)序列共含有139個(gè)氨基酸。根據(jù)Jug r 1的氨基酸一級(jí)序列，利用固相合成肽法合成重疊肽段，純度90%。每個(gè)肽段長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸，偏移量為3個(gè)氨基酸，含蓋了Jug r 1的全部一級(jí)序列。合成后采用高效液相色譜HPLC和質(zhì)譜進(jìn)行分析和鑒定，用于后續(xù)圓點(diǎn)印跡（Dot-blot）篩選肽段確定IgE線性表位。

為了篩選出與患者血清中特異性IgE結(jié)合的肽段，利用Dot-blot試驗(yàn)并參照參考文獻(xiàn)[10]的方法。用鉛筆在NC膜上輕畫(huà)1 cm×1 cm格子，之后用雙蒸水浸泡NC膜，直至膜全部濕潤(rùn)為止。從雙蒸水中取出NC膜，用濾紙吸去殘余在膜上的水分，在膜保持濕潤(rùn)狀態(tài)時(shí)點(diǎn)樣。每個(gè)格子中間點(diǎn)加2 μL蛋白肽段 （質(zhì)量濃度3 mg/mL），室溫下自然晾干。加入封閉液，將NC膜浸沒(méi)在封閉液中，室溫下封閉2 h后洗滌。加入按1∶10稀釋6位患者血清的一抗反應(yīng)液。4℃孵育過(guò)夜后洗滌。按1∶8 000稀釋的二抗加入NC 膜上，37℃下避光孵育1 h后洗滌。在NC膜上加入按1∶500稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃下避光孵育1 h后洗滌，HRP-DAB顯影5～15 min，觀察并拍照記錄得到的是否出現(xiàn)顯色條帶，以確定是某個(gè)肽段與特異性IgE結(jié)合，為表位區(qū)域所在。

利用Dot-blot試驗(yàn)篩選與小鼠血清中特異性IgE結(jié)合的肽段，方法同上。其中，將NC膜封閉后，加入1∶5稀釋的混合的致敏小鼠血清，作為一抗反應(yīng)液。4℃孵育過(guò)夜后洗滌。將1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgE抗體的二抗加入NC膜上，37℃下避光孵育1h后洗滌，HRP-DAB顯影5～15 min，觀察并拍照記錄得到的是否出現(xiàn)顯色條帶，以確定是某個(gè)肽段與特異性IgE結(jié)合，為表位區(qū)域所在。

2 結(jié)果及分析

2.1 生物信息學(xué)分析得到6個(gè)Jug r 1線性抗原表位

在獲得Jug r 1的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，利用DNAstar Protean軟件對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)的親水性、表面可及性、柔韌性以及抗原指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)分析Jug r 1的親水性（圖1a），親水性指數(shù)＞0的說(shuō)明親水性較好，結(jié)果表明，Jug r 1的親水性區(qū)域分布較不均勻，主要集中在中部和C末端。親水性較高的區(qū)域分別為AA20、AA23-139，親水性區(qū)域暴露于蛋白表面的幾率較高，從而形成抗原表位的幾率也較大。按Emini法對(duì)Jug r 1的表面可及性進(jìn)行分析（圖1b），以表面可及性指數(shù)＞1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示Jug r 1的氨基酸表面可及性較大的區(qū)域主要為 AA19、AA24～25、AA28～35、AA39、AA42～28、AA52、AA55～73、AA81～86、AA96～111、AA114、AA117～121、AA130、AA135 和 AA137。 這些表面可及性較強(qiáng)區(qū)域呈現(xiàn)在Jug r 1蛋白分子的表面，有利于與抗體結(jié)合，其成為抗原表位的可能性也較大。按Karplus-Schulz法對(duì)Jug r 1的柔性區(qū)域進(jìn)行分析 （如圖1c），發(fā)現(xiàn)主要集中在AA18～22、AA24～49、AA57～72、AA80～88、AA98～111、AA117～133 和 AA135～136。 這些區(qū)域由于具有一定的柔性，發(fā)生折疊、彎曲的幾率較大，形成表位的可能性較高，易與抗體發(fā)生結(jié)合。按Jameson-Wolf法分析Jug r 1的潛在抗原表位位點(diǎn)（如圖1d），以抗原指數(shù)＞0為篩選條件，結(jié)果顯示：抗原指數(shù)較高的區(qū)域?yàn)锳A20～21、AA23～53、AA57～58、AA81～89 和 AA91～139，提示這些區(qū)域含有潛在優(yōu)勢(shì)抗原表位。

圖1 Jug r 1的DNAstar Protean分析結(jié)果Fig.1 Result of the DNAstar Protean of Jug r 1

綜合以上各參數(shù)，將同時(shí)滿足4個(gè)參數(shù)篩選條件的表位預(yù)測(cè)為Jug r 1蛋白的可能表位位點(diǎn)（6個(gè)），如表2所示。DNAstar的結(jié)果表明：Jug r 1蛋白整體有幾個(gè)區(qū)域具有較高的抗原指數(shù)，推測(cè)可能存在多個(gè)抗原表位，即存在潛在的致敏性。雖然DNAstar軟件預(yù)測(cè)核桃蛋白表位的相對(duì)準(zhǔn)確性較高，但是DNAstar主要是基于氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)表位的預(yù)測(cè)有一定局限性，還需通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 DNAstar Protean預(yù)測(cè)得到的Jug r 1的線性表位Table2 The predicted linear epitopes on Jug r 1 by DNAstar Protean

2.2 肽段的合成和鑒定

根據(jù)Jug r 1的一級(jí)氨基酸序列，合成44個(gè)15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的肽段，如圖2所示。圖3中的A、B、C分別代表了1號(hào)肽 （氨基酸序列為1AALLVALLFVANAAA15）、6號(hào)肽 （氨基酸序列為16FRTTITTMEIDEDID30）和44號(hào)肽（氨基酸序列為125CGISSQRCEIRRSWF139）的液相和質(zhì)譜圖，其它合成肽譜圖略。以上3個(gè)肽段為此次試驗(yàn)篩選出的表位區(qū)域。合成肽經(jīng)高效液相純化和質(zhì)譜鑒定，純度為90%，可用于后續(xù)篩選抗原表位。

2.3 核桃過(guò)敏患者血清篩選出4個(gè)Jug r 1 IgE線性抗原表位

為了確定過(guò)敏患者血清中是否存在核桃主要過(guò)敏原Jug r 1的特異性IgE抗體，利用Western Blot分析過(guò)敏患者血清與Jug r 1的結(jié)合情況，在約15ku處可見(jiàn)明顯的條帶（圖4）。結(jié)果表明：6名過(guò)敏患者血清中均存在核桃中主要過(guò)敏原Jug r 1特異性的IgE抗體，且均可與Jug r 1發(fā)生特異性結(jié)合。這表明此血清對(duì)Jug r 1的特異性顯著，可用于后續(xù)表位的篩選。

進(jìn)一步利用上述鑒定的過(guò)敏患者血清檢測(cè)Jug r 1特異性抗原表位，將前述合成的44個(gè)肽段分別與6位過(guò)敏患者血清進(jìn)行Dot-blot實(shí)驗(yàn)，篩選出IgE結(jié)合肽段（圖5）。

圖2 合成的44個(gè)重疊肽段（長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸，偏移量為3個(gè)氨基酸）Fig.2 Amino acid sequences of 44 overlapping，synthetic peptides（length：15 amino acid，offset 3 amino acid）

圖 3 肽段 1號(hào)（a）、6號(hào)（b）和 44號(hào)（c）的 HPLC和質(zhì)譜Fig.3 The HPLC profile and mass spectrum of peptides in No.1（a），No.6（b） and No.44（c）

圖4 過(guò)敏患者血清與Jug r 1的Western Blot結(jié)果Fig.4 Result of Western Blot of allergic patients and Jug r 1

圖5 6名核桃過(guò)敏患者血清與重疊肽段的Dot-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Result of the dot-bot of 6 walnut-allergic patients’serums and overlapping peptides

合成的44個(gè)肽段中，有4個(gè)肽段可與全部過(guò)敏患者血清中的特異性IgE發(fā)生反應(yīng)，分別為肽段 1 （AA1-15，AALLVALLFVANAAA）、 肽段 2（AA4～18，LVALLFVANAAAFRT）、肽段 6（AA16～30，F(xiàn)RTTITTMEIDEDID）和肽段 44（AA125～139，CGISSQRCEIRRSWF），均與過(guò)敏患者血清發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明氨基酸序列上存在IgE活性區(qū)域。經(jīng) 確 定 ，肽 段 AA1～15、AA4～18、AA16～30 及AA125～139為過(guò)敏患者血清所識(shí)別的Jug r 1的IgE線性抗原表位區(qū)域。結(jié)合2.1節(jié)中生物信息學(xué)預(yù) 測(cè) 表位 結(jié) 果 AA28～35、AA42～49、AA55～62、AA65～73、AA97～104、AA109～121，有部分氨基酸序列重合。Robotham J M等[11]也利用過(guò)敏患者血清篩選出一個(gè)免疫顯性的抗原表位。而這段氨基酸序列與本研究中的過(guò)敏患者血清中的特異性IgE未發(fā)生結(jié)合，提示受試者的個(gè)體差異較大，不同的過(guò)敏患者會(huì)識(shí)別不同的抗原表位[12]。其中，患者A、B、E也與其它肽段有較弱的結(jié)合，提示不同的過(guò)敏患者血清，不同的表位肽段對(duì)過(guò)敏原蛋白的結(jié)合情況也不相同，表明不同的血清針對(duì)同一過(guò)敏蛋白的識(shí)別表位并不完全相同，這表現(xiàn)出抗原抗體的特異性。結(jié)合表1的患者信息，很多患者都同時(shí)對(duì)花生或榛果存在過(guò)敏反應(yīng)，提示核桃與花生或榛果存在交叉反應(yīng)，這在先前也有報(bào)道[13]。

2.4 核桃過(guò)敏原Jug r 1致敏小鼠血清篩選兩個(gè)Jug r 1 IgE線性抗原表位

通過(guò)構(gòu)建Balb/c小鼠致敏模型，收集42 d大刺激后的小鼠血清，用ELISA法測(cè)定Balb/c小鼠血清中特異性IgE和IgG1抗體水平，結(jié)果分別見(jiàn)圖6a、6b。經(jīng)口給予OVA和Jug r 1的小鼠血清中的特異性IgE和IgG1抗體水平均顯著性高于陰性對(duì)照PBS組（P＜0.05），說(shuō)明經(jīng)口給予Jug r 1蛋白可以誘發(fā)Balb/c小鼠產(chǎn)生Th2型抗體反應(yīng)，小鼠血清中存在與Jug r 1結(jié)合的特異性IgE抗體，即此血清對(duì)Jug r 1的特異性顯著，可用于后續(xù)表位的篩選。

進(jìn)一步利用上述經(jīng)鑒定的致敏小鼠血清，采用Dot-blot法篩選出致敏小鼠的血清中Jug r 1特異性IgE識(shí)別的抗原表位，如圖7所示。結(jié)果表明，小鼠可以識(shí)別出肽段1（1AALLVALLFVANAAA15）和肽段 44（125CGISSQRCEIRRSWF139），即肽段AA1-15及AA125-139為小鼠血清所識(shí)別的Jug r 1的IgE線性抗原表位區(qū)域。與2.3節(jié)中核桃過(guò)敏患者血清所識(shí)別的Jug r 1的IgE線性抗原表位區(qū)域肽段 AA1～15、AA4～18、AA16～30及AA125～139進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)致敏小鼠血清篩選出的兩個(gè)IgE線性抗原表位存在于過(guò)敏患者血清篩選出的4個(gè)IgE抗原表位中，提示可以利用小鼠血清替代人血清進(jìn)行過(guò)敏原IgE線性抗原表位的篩選實(shí)驗(yàn)，然而也會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，即部分IgE線性抗原表位沒(méi)能被識(shí)別。結(jié)合2.1節(jié)中生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表位結(jié)果AA28～35、AA42～49、AA55～62、AA65～73、AA97～104、AA109～121 沒(méi)有重合部分，提示要想準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)出構(gòu)象表位和線性表位，需要綜合應(yīng)用不同軟件對(duì)肽段表位進(jìn)行多角度、更全面的預(yù)測(cè)分析，其結(jié)果的準(zhǔn)確性一定會(huì)有所提高[14]。

圖6 Balb/c小鼠血清中特異性IgE和IgG1抗體水平Fig.6 The level of specific IgE and IgG1response in Balb/c mice

圖7 核桃過(guò)敏小鼠血清與重疊肽段的Dot-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Result of the dot-bot of walnut-allergic mice’serums and overlapping peptides

3 討論

目前在利用血清篩選食物過(guò)敏原表位的研究時(shí)，大多數(shù)仍然是采用相應(yīng)的食物過(guò)敏患者的血清，如Robotham J M等[15]在2002年對(duì)Jug r 1引起過(guò)敏癥狀的病人血清的IgE表位通過(guò)固相肽段合成并結(jié)合血清學(xué)篩選的方法鑒定，獲得一個(gè)免疫顯性的線性抗原表位，104QGLRGEEMEEMV115；Sordet C等[11]利用重疊肽庫(kù)篩選的方法鑒定出Jug r 1的4個(gè)能與人血清抗體結(jié)合的位點(diǎn)，分別是6IDNPRR11，42YDEDNQRQH50，72QVVRRQQQQ80及102CGISSQRCEIRR113。然而，人體血清庫(kù)的資源相對(duì)匱乏，且涉及到道德倫理問(wèn)題，其發(fā)展和利用受到限制。雖然血清學(xué)結(jié)果準(zhǔn)確、直觀，但是對(duì)血清質(zhì)量和數(shù)量要求較高，招募到較大量的受試者有一定的難度。若能采用動(dòng)物模型來(lái)模擬代替人類進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究則更為便利、可行，這也是本研究的目的所在。特別是在食物過(guò)敏原致敏性方面，很多大鼠小鼠致敏模型的成功建立，對(duì)研究食物過(guò)敏機(jī)制有很大的幫助。

有研究[16]利用小鼠血清和HMPV IgG陽(yáng)性人血清，利用55條合成肽，通過(guò)肽掃描分析技術(shù)，對(duì)HMPV F蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行初步篩選，結(jié)果顯示，33條多肽可與人血清反應(yīng)，12條多肽可與小鼠抗RSV F蛋白血清反應(yīng)，其中10條與人血清篩選結(jié)果重疊，說(shuō)明二者存在交叉性表位，與本研究結(jié)果相似，提示可利用小鼠血清替代人血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。S Denerypapini[17]在研究小麥過(guò)敏原LPT1的幾個(gè)連續(xù)表位時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)表位是患者和小鼠共同識(shí)別的，未折疊的蛋白既不能被患者識(shí)別也不能被小鼠IgE識(shí)別，然而B(niǎo)attais等[18]在研究小麥蛋白抗原表位時(shí)，利用小鼠和人血清篩選出的表位，肽段序列的交叉很低，難以重合，推測(cè)可能是在前一項(xiàng)研究中LTP1本身的特性所致，在IgE結(jié)合中LTP1折疊和不連續(xù)表位造成的差異，相比之下，許多連續(xù)表位可被患者和小鼠IgE所識(shí)別，這種麥醇溶蛋白或LTP1致敏的小鼠中的反應(yīng)以及與篩選出的IgE表位方面與患者的反應(yīng)相似，這也進(jìn)一步支持作者在篩選食物過(guò)敏原表位時(shí)小鼠模型替代的可行性。因種屬之間的差異或者過(guò)敏原本身的特性而導(dǎo)致不同研究結(jié)果之間的差異性，還需要更多的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。目前關(guān)于致敏動(dòng)物模型與過(guò)敏人群在抗原結(jié)合表位差異性的研究報(bào)道很少。在篩選抗原表位方面，小鼠與人之間的差異性還需更深入的研究。

總之，本研究利用固相合成肽法合成了44個(gè)覆蓋Jug r 1一級(jí)序列的重疊短肽，通過(guò)核桃過(guò)敏患者血清和致敏小鼠血清篩選出其IgE線性抗原表位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏患者可以識(shí)別的IgE結(jié)合的抗原表位肽段為1LVALLFVANAAA15、4LVALLFVANAAAFRT18、16FRTTITTMEIDEDID30及125CGISSQRCEIRRSWF139；小鼠識(shí)別其中兩個(gè)的抗原表位為1AALLVALLFVANAAA15和125CGISSQRCEIRRSWF139，提示在利用致敏動(dòng)物血清替代人血清進(jìn)行IgE線性抗原表位篩選時(shí)，所篩選出的IgE線性抗原表位也能夠被核桃過(guò)敏患者識(shí)別，然而也有一部分IgE表位不能被識(shí)別，需要結(jié)合其它方法進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證。