楊召俠 劉灑灑 高 寧 朱容仟 紀(jì)超凡 董秀萍 楊 松 閆曉明 林心萍*

（1大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034

2國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034

3安徽省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 合肥 230000）

臭鱖魚(yú)，又稱(chēng)為腌鮮魚(yú)，它是以新鮮鱖魚(yú)為原料，經(jīng)過(guò)發(fā)酵而得。鱖魚(yú)具有生長(zhǎng)快，肉嫩味美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)發(fā)酵作用，魚(yú)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪及其它有機(jī)物被降解成氨基酸、游離脂肪酸、核苷酸及其它小分子物質(zhì)，使得魚(yú)體散發(fā)出似臭非臭的氣味。再經(jīng)過(guò)烹飪，產(chǎn)生一種獨(dú)有的臭香味，臭鱖魚(yú)也因此得以聞名，成為傳統(tǒng)徽式名菜的代表。

臭鱖魚(yú)作為中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)制品，其生產(chǎn)現(xiàn)仍以家庭作坊式的自然發(fā)酵為主，周期長(zhǎng)，發(fā)酵工藝過(guò)程研究較少，關(guān)鍵工藝參數(shù)等的描述較為模糊，產(chǎn)品品質(zhì)難以控制。市場(chǎng)上采用傳統(tǒng)工藝加工的臭鱖魚(yú)極少。目前大部分飯店出售的臭鱖魚(yú)都采用臭豆腐熏制而成，其風(fēng)味物質(zhì)來(lái)源于臭豆腐，而非鱖魚(yú)肉自身發(fā)酵產(chǎn)生的。對(duì)臭鱖魚(yú)加工過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)及其特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究，是開(kāi)發(fā)臭鱖魚(yú)產(chǎn)品的前提和急待解決的問(wèn)題。

本試驗(yàn)中采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究臭鱖魚(yú)關(guān)鍵發(fā)酵工藝參數(shù)（發(fā)酵時(shí)間、鹽度、發(fā)酵溫度），采用感官評(píng)價(jià)篩選出品質(zhì)最優(yōu)的試驗(yàn)組，并用電子鼻和SPME（固相微萃?。?GC-MS檢測(cè)臭鱖魚(yú)產(chǎn)品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，為加快臭鱖魚(yú)的工業(yè)化進(jìn)程提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱖魚(yú)，購(gòu)自大連新長(zhǎng)興市場(chǎng)；調(diào)味料（八角、茴香、辣椒粉、孜然、花椒、蔥姜、食鹽等），沃爾瑪超市；2，4，6-三甲基吡啶，Aladdin 公司；C6-C20 正構(gòu)烷烴，Sigma公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

PEN3型便攜式電子鼻，德國(guó)AIRSENSE公司；Agilent 7890A/5975C-GC/MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備 根據(jù)查找資料[1-5]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，影響鱖魚(yú)發(fā)酵及口感的因素有：發(fā)酵時(shí)間、溫度、鹽度。利用Mini tab軟件設(shè)計(jì)3因素4水平正交試驗(yàn)表，做 L16（43）正交試驗(yàn)。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)方法 參考文獻(xiàn)[6]，選取具有食品感官評(píng)定基本知識(shí)的相關(guān)專(zhuān)業(yè)學(xué)生10名，事先進(jìn)行臭鱖魚(yú)加工知識(shí)、臭鱖魚(yú)審評(píng)標(biāo)準(zhǔn)及審評(píng)方法的培訓(xùn)。該10名學(xué)生組成感官評(píng)價(jià)小組，分別對(duì)產(chǎn)品的組織狀態(tài)、色澤、氣味、口感、滋味5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7-8]見(jiàn)表2。對(duì)感官評(píng)分結(jié)果按照組織狀態(tài)、色澤、氣味、口感、滋味分別占 0.1，0.1，0.15，0.3，0.35 的權(quán)重[7]計(jì)算分值。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels orthogonal text

表2 臭鱖魚(yú)的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table2 Sensory evaluation standard of the stinky mandarin fish

1.3.3 電子鼻檢測(cè)方法 發(fā)酵完成的鱖魚(yú)，蒸制10 min，取肉打漿；稱(chēng)取（10± 0.1）g樣品放入 40 mL頂空瓶中，加蓋密封，放入30℃恒溫箱中待檢。檢測(cè)前，用空氣對(duì)電子鼻檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行清洗。將電子鼻吸氣口插入樣品瓶中測(cè)定，測(cè)定時(shí)間70 s，可滿(mǎn)足所有的傳感器達(dá)到穩(wěn)定值；數(shù)據(jù)記錄的時(shí)間間隔是0.1 s[9]。空氣清洗探針的時(shí)間為60 s，檢測(cè)完成后保存數(shù)據(jù)。

電子鼻傳感陣列如表3所示。

表3 PEN 3型電子鼻傳感器陣列Table3 PEN 3 e-nose sensor arrays

1.3.4 GC-MS檢測(cè)方法 按照1.3.3節(jié)方法處理。稱(chēng)取3.0 g（精確至0.1 g）樣品貼壁放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋密封。將樣品在60℃下孵育30 min，萃取40 min完成抽取。

氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件：色譜柱為HP-5 MS，30 m×250 μm×0.25 μm（美國(guó)安捷倫公司）。

氣相色譜條件：初溫30℃，保持5 min；以3℃/min升至50℃，保持3 min；5℃/min升至150℃；20℃/min升至250℃，保持5 min[10]。進(jìn)樣口溫度 260 ℃，載氣流速（He）1.5 mL/min，不分流模式進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）電離模式，電子能量70 eV；全譜掃描，質(zhì)量掃描范圍29～400 u；四極桿檢測(cè)器溫度150℃。以與樣品相同的GC-MS條件檢測(cè)正構(gòu)烷烴，計(jì)算保留指數(shù)（RI）。利用NIST11譜庫(kù)檢索（MS）及RI值比對(duì)，對(duì)化合物進(jìn)行定性分析。

RI值計(jì)算公式：

式中：X——未知化合物；Z，Z+1——分別為未知化合物流出前、后正構(gòu)烷烴所含碳原子的數(shù)目；R（X），R（Z），R（Z+1）分別表示未知化合物及碳原子數(shù)為Z，Z+1正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量方法

1.3.5.1 內(nèi)標(biāo)物的配制 選用2，4，6-三甲基吡啶為內(nèi)標(biāo)，利用去離子水將2，4，6-三甲基吡啶配制成50 mg/L的母液，使用時(shí)將母液稀釋100倍，即質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，使用量為60 μL。

1.3.5.2 定量方法 通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)臭鱖魚(yú)中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量分析，用內(nèi)標(biāo)物的峰面積與揮發(fā)性化合物峰面積的比值計(jì)算化合物的濃度。計(jì)算公式：

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由感官評(píng)定小組對(duì)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的16組試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行感官評(píng)分，所得分?jǐn)?shù)按照方法1.3.2節(jié)所述進(jìn)行加權(quán)平均計(jì)分，結(jié)果見(jiàn)表4。B因素（發(fā)酵溫度）對(duì)感官評(píng)定的影響最大，其次是因素C（發(fā)酵鹽度），影響最小的為因素A（發(fā)酵時(shí)間）。感官評(píng)分最高的組合是A2B1C2，由極差得到影響感官評(píng)分的主次因素：B＞C＞A。根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)工藝組合為A2B3C2。綜上，臭鱖魚(yú)最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵時(shí)間7 d、發(fā)酵溫度12℃、添加鹽含量為6%。

表4 臭鱖魚(yú)的感官評(píng)分結(jié)果Table4 Sensory evaluation results of the stinky mandarin fish

2.2 電子鼻檢測(cè)結(jié)果

對(duì)發(fā)酵7d的鱖魚(yú)及新鮮鱖魚(yú)進(jìn)行電子鼻檢測(cè)，用SPSS軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）。主成分分析是設(shè)法將原來(lái)眾多具有一定相關(guān)性的幾個(gè)指標(biāo)，重新組合成一組新的互相無(wú)關(guān)的綜合指標(biāo)來(lái)代替原來(lái)的指標(biāo)，以評(píng)價(jià)原來(lái)變量的信息。在PCA主成分分析圖中，距離越遠(yuǎn)的兩組差異越大，距離越近的兩組差異越小。由表5可知第一主成分的貢獻(xiàn)率為98.171%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為1.252%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.423%，累計(jì)貢獻(xiàn)率大于80%可以進(jìn)行PCA分析[9]。利用Origin軟件制作PCA圖，結(jié)果如圖1所示。可以看出新發(fā)酵7d鱖魚(yú)與新鮮鱖魚(yú)的主成分有明顯的差異，可將發(fā)酵鱖魚(yú)與新鮮鱖魚(yú)區(qū)分開(kāi)。

采用雷達(dá)圖對(duì)電子鼻數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。發(fā)酵7 d的鱖魚(yú)與新鮮鱖魚(yú)相比R（5）（烴類(lèi)）、R（6）（芳香類(lèi)）、含硫類(lèi)化合物及醇類(lèi)變化明顯。提示臭鱖魚(yú)發(fā)酵前后，烴類(lèi)、芳香類(lèi)、含硫類(lèi)化合物及醇類(lèi)有較大改變。

表5 解釋的總方差Table5 Total variance explained

圖1 新鮮鱖魚(yú)與發(fā)酵7d的臭鱖魚(yú)主成分分析圖Fig.1 Principal component analyses of the fresh and stinky mandarin fish fermented 7 days

圖2 新鮮鱖魚(yú)及發(fā)酵7d的臭鱖魚(yú)電子鼻數(shù)據(jù)的雷達(dá)圖分析Fig.2 Radar map analysis of fermented 7 days and fresh Mandarin fish

2.3 GC-MS檢測(cè)結(jié)果

采用頂空固相微萃取的方法結(jié)合GC-MS分析新鮮鱖魚(yú)及臭鱖魚(yú)的揮發(fā)性物質(zhì)，得到發(fā)酵7 d及新鮮鱖魚(yú)的揮發(fā)性物質(zhì)。經(jīng)過(guò)NIST譜庫(kù)檢索，發(fā)酵鱖魚(yú)中檢出67種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，各種揮發(fā)性物質(zhì)及相對(duì)含量見(jiàn)表6。檢出的67種揮發(fā)性物質(zhì)中有醇類(lèi)17種，酮類(lèi)6種，醛類(lèi)5種，酸類(lèi)2種，酯類(lèi)3種，含氮化合物2種，含硫化合物2種，芳香族化合物11種和含碳?xì)浠衔?0種。在總的揮發(fā)性物質(zhì)中醇類(lèi)的總含量為10 887.04 ng/100 g，是主要的揮發(fā)性物質(zhì)；其次是酮類(lèi)4 106.79 ng/100 g，含氮化合物 3 140.08 ng/100g，醛類(lèi)136.51 ng/100 g，依次為含碳?xì)浠衔铩⒎枷阕寤衔?、酯?lèi)、酸類(lèi)及含硫化合物。而在新鮮鱖魚(yú)中共檢出30中揮發(fā)性物質(zhì)，依次為醛類(lèi) （3 827.61 ng/100 g），醇類(lèi) （276.49 ng/100 g），酮類(lèi)（201.31 ng/100 g），芳香族類(lèi)（169.10 ng/100 g），酯類(lèi)（131.87 ng/100 g），含碳?xì)浠衔铮?9.28 ng/100 g），含硫化合物（17.95 ng/100 g），酸類(lèi)（10.07 ng/100 g）及含氮化合物（2.13 ng/100 g）。可以看出發(fā)酵鱖魚(yú)與新鮮鱖魚(yú)相比，無(wú)論是揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)還是數(shù)量都存在明顯差異。

表6 臭鱖魚(yú)揮發(fā)性化合物分析Table6 Analysis of the volatile compounds of stinky mandarin fish

（續(xù)表6）

（續(xù)表6）

由表6可知，臭鱖魚(yú)中存在著大量的醇類(lèi)物質(zhì)，是新鮮鱖魚(yú)的39.38倍。其含量由高到低依次為α-松油醇、茴香甲醇、4-萜烯醇、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、1-甲基-4-（1-甲基亞乙基）-環(huán)己醇、1，3，3-三甲基雙環(huán)[2.2.1]-庚-2-醇、4，6，6-三甲基-[1S-（1α，2β，5α）]-雙環(huán)[3.1.1]庚-3-烯-2-醇、2-甲基-5-異丙基-二環(huán)[3.1.0]己烷-2-醇、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1-甲醇、2-庚炔-1-醇、1，5-脫水-2-脫氧-D-阿拉伯-己-1-烯醇、反式-3-賴(lài)氨-2-醇、1，14-十四烷二醇、4，7，7-三甲基-雙環(huán)[4.1.0]庚-3-醇、3，7，11-三甲基-1-十二烷醇。醇類(lèi)物質(zhì)被認(rèn)為是脂肪酸氧化的產(chǎn)物[11]，推測(cè)可能是鱖魚(yú)在發(fā)酵過(guò)程中，豐富的脂肪酸氧化分解為醇類(lèi)物質(zhì)，使其風(fēng)味增加。該結(jié)果與發(fā)酵魚(yú)露中檢測(cè)到幾種低濃度的酯類(lèi)及醇類(lèi)[12]對(duì)魚(yú)露的風(fēng)味起重要作用相類(lèi)似。

酮類(lèi)物質(zhì)含量是僅次于醇類(lèi)物質(zhì)含量的第二大類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)。從臭鱖魚(yú)中檢測(cè)的酮類(lèi)物質(zhì)總量為新鮮鱖魚(yú)的20.40倍，包括6種化合物，依次為 2-甲基-3-辛酮、胡椒酮、2（1H）-喹啉酮、對(duì)乙基苯乙酮、2，2，6-三甲基-反式-1-氧雜螺[2.5]辛-4-酮及 5，9-二甲基-2-（1-甲基乙基）-1-環(huán)癸酮。胡椒酮具有類(lèi)似樟腦和薄荷的香味，C4-C9酮類(lèi)物質(zhì)是通過(guò)β-氧化產(chǎn)生的，能夠產(chǎn)生較為強(qiáng)烈的氣味且有較低的閾值[13]，是食物重要的成香物質(zhì)。例如，發(fā)酵香腸[14]中2，3-辛二酮等酮類(lèi)是構(gòu)成其奶油香氣，賦予其特殊風(fēng)味的重要成分。

在發(fā)酵鱖魚(yú)中檢測(cè)到5種醛類(lèi)物質(zhì)，包括己醛、庚醛、壬醛、癸醛、（3，3-二甲基亞環(huán)己基）-乙醛。其中壬醛具玫瑰、柑橘等香氣，有強(qiáng)的油脂氣味。在發(fā)酵過(guò)程中，脂肪及脂肪組織發(fā)生脂解作用，產(chǎn)生的游離脂肪酸是氧化反應(yīng)的底物，脂肪氧化產(chǎn)生的主要物質(zhì)是醛類(lèi)[15]。脂肪醛具有較低的閾值，大部分具有灼燒后的味道[16]，也是構(gòu)成肉制品特殊風(fēng)味的重要物質(zhì)[17-18]。

在新鮮鱖魚(yú)中檢出1種酸類(lèi)化合物，在發(fā)酵鱖魚(yú)中檢出2種酸類(lèi)化合物，酸類(lèi)化合物大部分來(lái)自碳水化合物分解的產(chǎn)物[19]，還有一部分來(lái)自脂肪的氧化和氨基酸的微生物發(fā)酵[16]。在發(fā)酵鱖魚(yú)中的兩種酸類(lèi)分別是油酸和棕櫚酸，這些長(zhǎng)鏈脂肪酸是滋味和風(fēng)味物質(zhì)的前提物質(zhì)，而在腌制食品中不能直接提高產(chǎn)品的感官[20]。

發(fā)酵7d鱖魚(yú)與新鮮鱖魚(yú)中酯類(lèi)含量相差不多，種類(lèi)成分明顯差異。通常，酯類(lèi)物質(zhì)會(huì)賦予產(chǎn)品香甜的果香味[21]。酯類(lèi)是微生物利用醇和酸進(jìn)行酯化作用產(chǎn)生的[19]。其中甲酸庚酯、己酸甲酯具有堯尾和玫瑰底香果香，有似梅子的甜的香韻[22]。這些酯類(lèi)物質(zhì)賦予臭鱖魚(yú)獨(dú)特的酯香味。

含氮化合物在發(fā)酵的鱖魚(yú)中共檢測(cè)到2種，含量很高。 吲哚（3 097.71 ng/100 g），4-（氨基甲基）-1-乙基吡啶（42.37 ng/100 g），吲哚的含量較高，并具有較低的閾值，在新鮮鱖魚(yú)中檢測(cè)到少量的吲哚（2.13 ng/100 g），推測(cè)吲哚為發(fā)酵鱖魚(yú)的特征性風(fēng)味物質(zhì)，主要存在于花油中，呈花香味。在發(fā)酵的鱖魚(yú)中共檢測(cè)出1種含硫化合物二甲基四硫醚（12.31 ng/100 g），主要是在發(fā)酵過(guò)程中微生物分解蛋氨酸產(chǎn)生的[19]，含硫化合物使食品產(chǎn)生不愉快的味道。

芳香族化合物檢測(cè)到11種，含量依次為茴香腦、苯酚、雙戊烯、4-甲基苯酚、鄰二甲苯、萘、乙基苯、異丙烯基甲苯、苯甲醛、（1-甲氧基-4-甲基-3-戊烯基）-苯。茴香腦又稱(chēng)茴香烯，是植物中的一種化學(xué)物質(zhì)，存在于八角小茴香中，帶有甜味，具有茴香特殊的香味[23]。其中雙戊烯又稱(chēng)為檸檬烯，具有檸檬香味，從干發(fā)酵香腸中檢測(cè)出雙戊烯[24]。一些酚類(lèi)化合物具有藥香味[16]。這些化合物賦予發(fā)酵鱖魚(yú)特有的發(fā)酵的味道。

發(fā)酵7 d，從鱖魚(yú)中共檢測(cè)到20種碳?xì)浠衔?，為新鮮鱖魚(yú)的30.20倍。其中β-羅勒烯、松油烯、水芹烯、羅漢柏烯、α-柏木萜烯及反-菖蒲烯是植物中的化學(xué)物質(zhì)具有特殊的香味[23，25]。在發(fā)酵的鱖魚(yú)中檢測(cè)到這種香味，可能是由于發(fā)酵時(shí)放入的植物香料在發(fā)酵過(guò)程中釋放到發(fā)酵體系中，后被發(fā)酵體系中的鱖魚(yú)吸收。

在所有檢測(cè)到的化合物中，變化最明顯的是醇類(lèi)化合物、酮類(lèi)化合物及烯烴類(lèi)化合物，推測(cè)這些風(fēng)味成分的改變可能與臭鱖魚(yú)的特殊風(fēng)味有關(guān)。

3 結(jié)論

利用正交試驗(yàn)對(duì)臭鱖魚(yú)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵時(shí)間7 d、發(fā)酵溫度12℃、添加鹽含量6%，在此條件下生產(chǎn)的臭鱖魚(yú)魚(yú)肉呈獨(dú)特的蒜瓣?duì)?，具有?dú)特的香臭味及回香味。利用電子鼻可明顯區(qū)分新鮮鱖魚(yú)和發(fā)酵后鱖魚(yú)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中烴類(lèi)、芳香類(lèi)、含硫類(lèi)化合物及醇類(lèi)有明顯的變化。采用SPME-GC-MS對(duì)鱖魚(yú)的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到67種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括醇類(lèi)17種，酮類(lèi)6種，醛類(lèi)5種，酸類(lèi)2種，酯類(lèi)3種，含氮化合物2種，含硫化合物1種，芳香族化合物11種和含碳?xì)浠衔?0種。鱖魚(yú)發(fā)酵前、后醇類(lèi)化合物增加了39.38倍，酮類(lèi)化合物增加20.40倍，碳?xì)漕?lèi)化合物增加30.20倍，含氮化合物1471.00倍，推測(cè)這些風(fēng)味成分的改變可能與臭鱖魚(yú)的特殊風(fēng)味有關(guān)。