汪薛良，鈕成拓，包敏，李崎，王金晶*

1(江南大學(xué)，釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

β-淀粉酶，又稱麥芽糖苷酶[1]，是一種外切型糖化酶。它能從淀粉的非還原性末端開始依次切開間隔的α-1,4糖苷鍵生成麥芽糖和β-極限糊精[2]。β-淀粉酶被廣泛應(yīng)用于食品糧食加工、發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)[3]，是一種需求量巨大的重要工業(yè)用酶，在啤酒釀造，β-淀粉酶作為糖化劑也有著不可替代的作用[4]。

β-淀粉酶主要來源于一些高等植物及少數(shù)微生物，如大麥、甘薯、水稻、芽孢桿菌等。植物來源的β-淀粉酶的酶活力普遍較高，溫度穩(wěn)定性較好，作用pH范圍較廣[5]，相比于植物來源的β-淀粉酶，微生物來源的β-淀粉酶最適溫度和熱穩(wěn)定性普遍較低[6]。目前，工業(yè)所使用的β-淀粉酶主要來自于植物提取與微生物發(fā)酵，其中大麥提取的β-淀粉酶由于其應(yīng)用效果好而深受工廠的青睞，但是大麥中的β-淀粉酶含量不高，提取工藝復(fù)雜導(dǎo)致其提取成本較高，且耗費(fèi)大量糧食[7]。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶雖然產(chǎn)量高，但是通常由于其穩(wěn)定性不夠而難以達(dá)到好的使用效果，因此研究者們開始關(guān)注于微生物異源表達(dá)植物來源的β-淀粉酶。張蕭蕭等構(gòu)建并篩選得到了1株高分泌表達(dá)大麥β-淀粉酶的重組巴斯德畢赤酵母GS-BBA，重組酵母在搖瓶發(fā)酵條件下的酶活為180 U/mL[8]；許黎明等還將大豆β-淀粉酶在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高密度發(fā)酵表達(dá)，經(jīng)過混合碳源誘導(dǎo)后的酶活達(dá)到了310 U/mL[9]。但是由于畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)往往需要添加甲醇，難以直接應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。另外還有大量研究者將大麥β-淀粉酶導(dǎo)入大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)，但是發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)出的β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性較差，容易被降解而失去活力[10-11]。

由于目前階段大麥β-淀粉酶的微生物重組表達(dá)均存在一定的缺陷，需要找到一個(gè)合適的宿主來進(jìn)行大麥β-淀粉酶的重組表達(dá)?？莶菅挎邨U菌是非致病性的革蘭氏陽(yáng)性菌，不含內(nèi)毒素，且發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，分泌蛋白能力強(qiáng)，是一類重要的工業(yè)酶制劑生產(chǎn)菌種。全球大約有50%的工業(yè)酶制劑是由枯草芽孢桿菌生產(chǎn)[12]，是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局授予GRAS(公認(rèn)安全)的微生物，被歸入食品級(jí)微生物范疇[13]。因此開發(fā)利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)食品添加劑將成為主要趨勢(shì)。WB800為敲除了8個(gè)蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌菌株，可更加高效地表達(dá)重組蛋白且便于后續(xù)的蛋白質(zhì)提純。因此，本研究選用枯草芽孢桿菌WB800作為宿主來異源表達(dá)大麥來源的β-淀粉酶，探索其分泌表達(dá)大麥β-淀粉酶基因的可行性并對(duì)重組表達(dá)的β-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質(zhì)粒與試劑

大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌WB800，均為本研究室前期保藏；大麥β-淀粉酶基因的載體pET-28a(+)-amyB,為本研究室前期所構(gòu)建[10]；pP43NMK，為張曉舟博士所構(gòu)建的枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)質(zhì)粒載體[14]，于本研究室保藏。載體限制性內(nèi)切酶、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒，購(gòu)自大連TaKaRa生物工程有限公司；無縫克隆試劑盒SoSoo，購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、Cycle Pure PCR產(chǎn)物回收試劑盒等，購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-tek公司；β-淀粉酶試劑盒、BETAMYL-3，購(gòu)自愛爾蘭Megazyme公司；商品β-淀粉酶，購(gòu)自北京生東科技公司；其他試劑均為國(guó)藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5、蛋白胨10、NaCl 10。

Superrich培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、酵母膏20、蛋白胨25、K2HPO43。

SP-A鹽溶液(g/L)：(NH4)2SO44、K2HPO4·3H2O 28、 KH2PO412、二水合檸檬酸三鈉2。

SP-B鹽溶液(g/L)：MgSO4·7H2O 0.4。

100×CAYE溶液(g/L)：酪蛋白水解物20、酵母膏100。

SPI培養(yǎng)基(20 mL)：9.8 mL SP-A鹽溶液、9.8 mL SP-B鹽溶液、200 μL葡萄糖溶液、200 μL 100×CAYE溶液。

SPⅡ培養(yǎng)基(6 mL)：5.8 mL SPI培養(yǎng)基、60 μL 50 mmol/L CaCl2溶液、60 μL 250 mmol/L MgCl2溶液、80 μL雙蒸水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究中表達(dá)載體的構(gòu)建采用的是無縫克隆的方法，相比于傳統(tǒng)的雙酶切連接法更加高效。以pET-28a(+)-amyB為模板，根據(jù)pP43NMK中插入的基因兩端酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物如下：

P1(F): AACACATGCCTCAGCATGGAAGTTAATGTGAAGGGCAAC；

P2(R): TGATTACGCCAAGCTTTACATTGTCGCAGGCAGTTCG。

PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min； 56 ℃退火45 s；72 ℃延伸2 min；72 ℃再延伸5 min，循環(huán)30次。同時(shí)采用Hind Ⅲ、PstI限制性內(nèi)切酶將pP43NMK線性化后，切膠回收純化后按照說明書上的反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌[15]。雙酶切驗(yàn)證正確后采用EGTA螯合的方法將得到的重組質(zhì)粒pP43NMK-amyB轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌[16]。

1.2.2 重組酶的表達(dá)與純化

將重組枯草芽孢桿菌接種至50 mL含Kan的Superrich液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取培養(yǎng)液測(cè)定OD600與酶活力值，在酶活力值得到峰值時(shí)收集菌液，于4 ℃、6 000 r/min離心20 min收集上清液。向上清液中緩慢加入粉末狀(NH4)2SO4至不同終點(diǎn)飽和度(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)，4 ℃靜置過夜。次日將得到的溶液分別離心后測(cè)定上清液的酶活力值，確定二次鹽析最適飽和度后，取發(fā)酵上清液加入低飽和度的(NH4)2SO4去除雜蛋白，再加入高飽和度(NH4)2SO4沉淀蛋白。用20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液溶解沉淀后放入截留分子質(zhì)量為3 500 kDa的透析袋中并置于去離子水中透析過夜，期間數(shù)次更換去離子水。得到的溶液采用Hi Trap QHP陰離子交換柱純化，柱體積為5 mL， 上樣量為30 mL，流速為2 mL/min，先后采用含0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。收集洗脫峰并測(cè)定酶活，采用截留分子質(zhì)量為10 kDa的蛋白超濾濃縮離心管對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后將得到的溶液置于4 ℃保存。

1.2.3 重組酶的酶活力測(cè)定

β-淀粉酶酶活力的測(cè)定采用DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)法，首先取6支25 mL具塞比色管，分別加入0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 g/L)，然后向各管中加入蒸餾水至2 mL，再加入3 mL DNS試劑，沸水浴加熱10 min，取出冷卻至室溫，取2 mL反應(yīng)液加蒸餾水稀釋至10 mL。混勻后以未加麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的比色管為對(duì)照在 540 nm 下測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出其線性回歸方程為y=2 979+0.022 6(R2=0.993 5)。進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)分別加入1 mL酶液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋)與1 mL 1%淀粉溶液，55 ℃恒溫水浴10 min，置于冰水浴2 min終止反應(yīng)，然后加入3 mL DNS試劑，混勻，沸水浴中煮沸10 min，取出冷卻至室溫，取2 mL反應(yīng)液用蒸餾水定容至10 mL，以蒸餾水代替酶液為空白，在540 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算酶活力,如公式(1)：

(1)

式中:E，樣品溶液吸光度；n，樣品溶液的稀釋倍數(shù)；5，2 mL反應(yīng)液換算成10 mL的倍數(shù)；6，10 min反應(yīng)時(shí)間換算成1 h；h，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

酶活單位定義為1 mL酶液最適條件下1 h水解質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%可溶性淀粉液生成1 mg麥芽糖為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)

最適溫度，以5 ℃為1個(gè)間隔，分別測(cè)定純化后β-淀粉酶酶液在40 ～70 ℃下的酶活力值(每次測(cè)定設(shè)置3份平行樣，下同)，設(shè)酶活力值最高值為100%，計(jì)算其他溫度下的相對(duì)酶活，以確定最適溫度。

最適pH，采用不同pH的緩沖液體系配制底物反應(yīng)緩沖液，以0.5個(gè)pH單位為一個(gè)間隔，分別測(cè)定β-淀粉酶在pH 3～8的酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算其他pH下的相對(duì)酶活，以確定最適pH。

溫度穩(wěn)定性，將β-淀粉酶酶液分別在50和 60 ℃ 條件下處理不同時(shí)間再測(cè)定酶活，以未經(jīng)過熱處理的酶液作為對(duì)照，測(cè)定其反應(yīng)液在540 nm處的吸光度，并將其酶活值設(shè)為100%，不同處理時(shí)間下的酶活值除以最大值所得百分?jǐn)?shù)即為該處理時(shí)間下的剩余酶活。剩余酶活降低至50%時(shí)所需的時(shí)間即為酶活力半衰期。

1.2.5 糖化實(shí)驗(yàn)

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的麥芽糊精樣品4份，調(diào)溶液pH值至5.5并在55 ℃下預(yù)熱一段時(shí)間，分別加入50 U/g(干基)的重組β-淀粉酶、1 U/g的普魯蘭酶和50 U/g(干基)的重組β-淀粉酶、50 U/g(干基)的大麥β-淀粉酶和50 U/g(干基)商品β-淀粉酶，于恒溫水浴鍋中55 ℃糖化48 h，定時(shí)取樣用高效液相色譜檢測(cè)麥芽糖生成量。

1.2.6 高效液相色譜分析條件

首先對(duì)糖液樣品進(jìn)行70%乙醇沉淀處理，靜置2 h 后離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔膜過濾后進(jìn)樣。色譜條件：Agilent Waters X-Bridge氨基柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；示差檢測(cè)器；流動(dòng)相乙腈體積分?jǐn)?shù)為75%；流速1 mL/min；柱溫：室溫。麥芽糖生成率以生成的麥芽糖總量除以麥芽糊精(絕干)總質(zhì)量表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建與鑒定

將PCR擴(kuò)增得到的amyB基因與線性化的在質(zhì)粒載體進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選得到片段與載體成功連接的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖1-A所示，可以看出片段大小在1.6 kbp處，與目的片段大小相符，說明重組表達(dá)載體pP43NMK-amyB構(gòu)建成功。將其轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800，菌落PCR結(jié)果如圖1-B，其中約80%為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子接種至含kan的液體培養(yǎng)基中可正常生長(zhǎng)，說明重組枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800/pP43NMK-amyB(WB-amyB)構(gòu)建成功。

A-重組質(zhì)粒pP43NMK-amyB的雙酶切電泳圖；B-重組枯草芽孢桿菌WB800菌落PCR結(jié)果圖1 重組菌的構(gòu)建與驗(yàn)證Fig.1 Construction and verification of recombinant B. subtilis WB800/pP43NMK-amyB注：M-DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 圖1-A中，1-pP43NMK-amyB的雙酶切；圖1-B中，1～10-單菌落編號(hào)。

2.2 重組菌的發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)程

在1 L三角瓶中進(jìn)行重組菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣測(cè)定OD600與酶活力，結(jié)果如圖2所示。重組菌WB-amyB在培養(yǎng)12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)至24 h 后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)速率維持穩(wěn)定，β-淀粉酶酶活力不斷上升，說明重組菌進(jìn)入穩(wěn)定期后能夠持續(xù)地合成與分泌β-淀粉酶。在培養(yǎng)約80 h時(shí)產(chǎn)酶水平達(dá)到峰值，此時(shí)酶活力值為386 U/mL，此后酶活力值稍有減低，之后基本維持不變，即培養(yǎng)80 h為最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

圖2 重組菌的生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酶曲線Fig.2 Growth curve and enzyme production curve of recombinant strain

2.3 重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的分離純化

搖瓶發(fā)酵約80 h時(shí)將發(fā)酵液離心收集上清液，首先采用鹽析的方法對(duì)上清液進(jìn)行粗提純。分別加入飽和度為10%～70%的(NH4)2SO4，測(cè)定每一步中上清液與沉淀的酶活力，得到鹽析曲線如圖3所示，可以看出當(dāng)(NH4)2SO4飽和度為20%時(shí)β-淀粉酶開始析出，60%時(shí)完全析出。所以在進(jìn)行鹽析提純時(shí)先加入20%飽和度的(NH4)2SO4去除雜蛋白，離心棄沉淀后再向上清中加入40%的(NH4)2SO4，收集沉淀并用去離子水復(fù)溶，得到的樣品透析過夜之后采用QHP陰離子交換柱純化蛋白樣品。純化過程中測(cè)定每個(gè)步驟酶的比活力與回收率，結(jié)果如表1所示，可以看出經(jīng)過QHP離子交換純化后酶的比活力達(dá)到613 U/mg，回收率為41%。同時(shí)采用凝膠色譜柱Superdex G75對(duì)同一品種大麥β-淀粉酶制劑進(jìn)行純化[10]。收集重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的蛋白洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，可以看出純化后的重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶均為單一條帶，大小約為59 kDa。

表1 重組枯草芽孢桿菌分泌β-淀粉酶純化過程Table 1 Purification process of β-amylase produced by recombinant B.subtilis

圖3 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀提純重組β-淀粉酶Fig.3 Purification of recombinant β-amylase by ammonium sulfate fractional precipitation

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1-含空質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；2-含重組質(zhì)粒的重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；3-純化后的重組β-淀粉酶；4-純化后的大麥β-淀粉酶圖4 純化的重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE results of recombinant β-amylase and barley β-amylase

2.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)

分別測(cè)定和比較了純化后重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的比酶活以及最適溫度、最適pH值和50、60 ℃條件下的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果如表2與圖5所示。純化后的重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的比酶活分別為613和661 U/mg，說明枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)的重組β-淀粉酶的催化性質(zhì)沒有改變。

表2 大麥β-淀粉酶與重組β-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)比較Table 2 Comparative of enzymatic properties between recombinant β-amylase and purified barley β-amylase

將純化后的β-淀粉酶在不同溫度下反應(yīng)10 min測(cè)定其最適反應(yīng)溫度。從圖5-A可以看出重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶的最適溫度均為55 ℃，且在溫度高于55 ℃后酶活迅速下降，重組β-淀粉酶在65 ℃ 下的相對(duì)酶活約為40%。

將純化后的β-淀粉酶用不同pH的磷酸鹽緩沖液稀釋后測(cè)定其相對(duì)酶活。從圖5-B中可以看出重組β-淀粉酶的最適pH值為5.0，其在pH 3.5～5.5能保持較高的酶活力，在pH>5.5時(shí)酶活力下降明顯。而大麥β-淀粉酶的最適pH值 為6.0，在pH 4.5～7 相對(duì)酶活能維持在80%左右。與大麥β-淀粉酶相比，重組β-淀粉酶的最適pH降低了1.0，且在pH 3～5的相對(duì)酶活也要高于大麥β-淀粉酶，其適應(yīng)的pH范圍也向酸性方向發(fā)生了偏移。這說明枯草芽孢桿菌重組表達(dá)的β-淀粉酶的耐酸性增強(qiáng)了。

將純化后的β-淀粉酶分別放置在50、60 ℃條件下，每隔10 min取樣測(cè)其相對(duì)酶活，得到溫度穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖5-C與圖5-D所示。由圖5-C可以看出重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶在50 ℃條件下作用時(shí)酶活力均緩慢下降，作用80 min后仍能保持60%左右的酶活力，且50 ℃條件下大麥β-淀粉酶的溫度穩(wěn)定性稍優(yōu)于重組β-淀粉酶。由圖5-D可以看出60 ℃條件下作用時(shí)大麥β-淀粉酶的熱失活曲線也比重組β-淀粉酶稍微緩慢，重組β-淀粉酶與大麥β-淀粉酶在60 ℃時(shí)的半衰期分別為49和41 min，60 ℃作用1 h后酶活力殘留30%和40%。

2.5 重組β-淀粉酶的應(yīng)用效果

為了考察重組β-淀粉酶單獨(dú)使用以及與普魯蘭酶聯(lián)合使用的實(shí)際應(yīng)用效果，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的麥芽糊精作為底物溶液進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。并以大麥β-淀粉酶、商品β-淀粉酶作為對(duì)照，麥芽糖生成量采用高效液相色譜進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。

A-最適溫度；B-最適pH；C-50 ℃溫度穩(wěn)定性；D- 60 ℃溫度穩(wěn)定性圖5 純化的大麥β-淀粉酶與重組β-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)比較Fig.5 Comparative of enzymatic properties between recombinant β-amylase and purified barley β-amylase

圖6 不同來源β-淀粉酶水解麥芽糊精產(chǎn)生麥芽糖過程Fig.6 Maltose production from maltodextrin hydrolyzed by different sources of β-amylase

添加相同酶活的重組β-淀粉酶、大麥β-淀粉酶水解生成麥芽糖的能力相似，其麥芽糖最終轉(zhuǎn)化率分別為60.77%和62.41%，而商品來源β-淀粉酶的麥芽糖轉(zhuǎn)化率則為55.04%，略低于前兩者，這說明枯芽孢桿菌重組表達(dá)的β-淀粉酶完全可以替代大麥β-淀 粉酶的作用。在重組β-淀粉酶中添加普魯蘭酶之后，可明顯提高麥芽糖的生成速率以及轉(zhuǎn)化率，在相同的條件下添加普魯蘭酶的重組β-淀粉酶的麥芽糖最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.87%，說明重組β-淀粉酶與普魯蘭酶聯(lián)用達(dá)到的效果可以滿足高麥芽糖漿的生產(chǎn)。

3 討論

β淀粉酶主要來源于植物和微生物，如大麥，甘薯，芽孢桿菌等。植物來源的β-淀粉酶通常具有更高的耐熱性和催化活性，但是其提取效率低、成本高且受季節(jié)因素影響。微生物來源的β-淀粉酶在生產(chǎn)上不受季節(jié)的影響，更適合規(guī)?；a(chǎn)和自動(dòng)化控制[17]，因此使用微生物表達(dá)植物來源β-淀粉酶成為淀粉酶應(yīng)用領(lǐng)域中的一個(gè)重要目標(biāo)。而枯草芽孢桿菌本身就有產(chǎn)淀粉酶系的菌株，且發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，分泌蛋白能力強(qiáng)，因此枯草芽孢桿菌是異源表達(dá)β-淀粉酶的理想宿主。

本研究將大麥來源的β-淀粉酶基因amyB導(dǎo)入枯草芽孢桿菌WB800，構(gòu)建的重組菌WB-amyB可以穩(wěn)定分泌表達(dá)β-淀粉酶，將本研究與其他異源表達(dá)的β-淀粉酶研究相比較，結(jié)果見表3。

在異源表達(dá)大麥β-淀粉酶的研究中，目前未見文章報(bào)道過在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)大麥β-淀粉酶的異源表達(dá)，枯草芽孢桿菌是一種食品安全的宿主，其表達(dá)的重組酶可直接分泌到胞外，便于酶的提純。本研究以枯草芽孢桿菌WB800作為宿主，在搖瓶發(fā)酵水平中的酶活力值可以達(dá)到386 U/mL，高于已有文獻(xiàn)報(bào)道[8,18-20]。重組β-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)與大麥β-淀粉酶相比幾乎相同，保留了大麥β-淀粉酶相對(duì)較好的耐熱性與穩(wěn)定性，且重組β-淀粉酶在偏酸性的環(huán)境中穩(wěn)定性更強(qiáng)，因此在需要耐酸性β-淀粉酶的工業(yè)中具有一定的應(yīng)用潛力。重組β-淀粉酶水解產(chǎn)生麥芽糖的能力與大麥β-淀粉酶相當(dāng)，與普魯蘭酶聯(lián)用時(shí)麥芽糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)81.8%，可直接用于生產(chǎn)高麥芽糖漿。

表3 不同來源β-淀粉酶表達(dá)情況的比較Table 3 Comparison ofexpression properties of different sources of β-amylase

有文獻(xiàn)報(bào)道采用大腸桿菌異源表達(dá)的植物β-淀粉酶熱穩(wěn)定性下降，容易被降解而失去活力[10-11]，采用畢赤酵母作為宿主異源表達(dá)的β-淀粉酶雖然酶學(xué)性質(zhì)沒有發(fā)生改變，但是酵母表達(dá)系統(tǒng)難以實(shí)現(xiàn)淀粉酶水解酶系的異源高表達(dá)，其原因尚不清楚[23]?？莶菅挎邨U菌表達(dá)的異源蛋白一般通過普通分泌途徑(Sec)分泌到胞外，在蛋白穿膜之后，信號(hào)肽酶會(huì)切除信號(hào)肽，使蛋白質(zhì)折疊成正確的構(gòu)象[24]，而大腸桿菌表達(dá)異源蛋白時(shí)一般為胞內(nèi)表達(dá)，不存在跨膜過程，因此異源蛋白可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的折疊，且大腸桿菌在表達(dá)異源蛋白時(shí)容易形成包涵體，酶的性質(zhì)可能也會(huì)因此受到一定的影響。

本研究?jī)H測(cè)定了重組枯草芽孢桿菌在搖瓶發(fā)酵水平上的產(chǎn)酶活力，下一步將采用罐式發(fā)酵對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行探究，使重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶量進(jìn)一步提高。此外，對(duì)大麥β-淀粉酶基因改造的研究一直以來也頗受關(guān)注，有學(xué)者通過比對(duì)不同熱穩(wěn)定性的大麥等位基因，采用定點(diǎn)突變的方法提高了大麥β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性與催化活性[25]，另外還有學(xué)者通過移除大麥β-淀粉酶C末端4個(gè)富含甘氨酸的片段發(fā)現(xiàn)其與底物的親和力以及熱穩(wěn)定性都有了顯著提高[26]。本研究所表達(dá)的大麥β-淀粉酶基因來自于一株野生大麥品種Haruna Nijo (GenBank：BAA04815.1)。故在枯草芽孢桿菌異源表達(dá)的基礎(chǔ)上可通過氨基酸序列比對(duì)等手段對(duì)其基因序列進(jìn)行改造，提高其穩(wěn)定性與催化活性，從而獲得性質(zhì)更加優(yōu)良的重組β-淀粉酶。