王艷，李亞歡，莫宇麗，胡晶晶，張怡馨，王杰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

麥角硫因(ergothioneine, ERG)，學(xué)名為2-巰基-L-組氨酸三甲基內(nèi)鹽，具有顯著的抗氧化[1]、抗炎[2]、保護(hù)細(xì)胞[3]、護(hù)色[4]和抗紫外輻射[5]等多種功能，是一種天然的抗氧化劑。區(qū)別于其他常見抗氧化劑(如谷胱甘肽、抗壞血酸等)，麥角硫因被人體或其他動(dòng)物從飲食中迅速吸收后，不會(huì)被快速代謝或排泄到尿液中，而是以硫酮形式存在于人體組織和體液中，因而不易發(fā)生自動(dòng)氧化并能在某些組織和體液中累積至較高水平[6]。強(qiáng)大的體外抗氧化性、獨(dú)特的抗自動(dòng)氧化性和天然安全性使麥角硫因在食品添加、保健制藥、化妝護(hù)膚等各個(gè)領(lǐng)域極具開發(fā)和利用價(jià)值，市場潛力巨大[7-8]。

除一些細(xì)菌(如放線菌、藍(lán)細(xì)菌)和部分真菌(如鏈霉菌、分枝桿菌)等微生物外，人體或動(dòng)物機(jī)體自身均無合成麥角硫因的能力，只能從食物中攝取[9]。早期研究表明，在合成麥角硫因的微生物中，杏鮑菇、香菇等食用菌中麥角硫因含量較高，又具有天然安全、易獲取等優(yōu)勢，成為其制備資源的首選[10]。其中，CHEN等研究發(fā)現(xiàn)側(cè)耳屬食用菌中麥角硫因含量相當(dāng)高[11]。DUBOST等也發(fā)現(xiàn)杏鮑菇(king oyster mushroom)中麥角硫因含量較高，可達(dá)2 590 mg/kg干重，遠(yuǎn)大于香菇、灰樹花等其他人工栽培蘑菇(210～198 mg/kg干重)[12]，表明杏鮑菇是制備麥角硫因的理想資源之一。除來源外，提取方式、純化方法、物化環(huán)境等因素均會(huì)對(duì)麥角硫因體外抗氧化性及其穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[13-15]。因此，研究杏鮑菇麥角硫因的體外抗氧化力及環(huán)境因素對(duì)其穩(wěn)定性的影響有利于實(shí)現(xiàn)麥角硫因的快速開發(fā)和高效應(yīng)用。目前，國內(nèi)外對(duì)麥角硫因的研究多集中于功能特性[6,16]，關(guān)于杏鮑菇麥角硫因的報(bào)道較少，而對(duì)其體外抗氧化活性及穩(wěn)定性的研究尚未見報(bào)道。

本文考察杏鮑菇中麥角硫因的常見體外自由基(如羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基等)清除能力及其對(duì)貯藏魚肉的保鮮效果，分析其體外抗氧化活性，并研究不同環(huán)境因素對(duì)其抗氧化能力穩(wěn)定性的影響，將為其在各領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用廣東藍(lán)田食用菌公司提供的杏鮑菇，真空冷凍干燥后低溫保藏備用。

KOH、FeCl3、乙二胺四乙酸二鈉、HCl、乙醇、KH2PO4、H3PO4等，廣州成碩公司；2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、谷胱甘肽、脫氧核糖，天津凱通試劑公司；硫代巴比妥酸(TBA)、抗壞血酸、H2O2、三吡啶基三嗪(TPTZ)，天津科密歐試劑公司；叔丁基對(duì)苯二酚(TBH)，上海撫生試劑公司；三氯乙酸(TCA)、2,4-二硝基苯肼(DNPH),北京索萊寶有限公司。未注明試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器和設(shè)備

LC2130高效液相色譜儀，上海天美儀器公司；TG16K-Ⅱ冷凍高速離心機(jī)，長沙東旺公司；FD-1-50冷凍真空干燥機(jī)，天津比朗儀器公司；UV1102分光光度計(jì)，上海天美儀器公司；UV2300Ⅱ系列雙光束紫外分光光度計(jì)，上海天美公司；PB-10 pH計(jì)，德國賽多利斯。

1.3 方法

1.3.1 杏鮑菇麥角硫因的提取純化和檢測

取一定量冷凍干燥的杏鮑菇干粉，按照料液比1∶48 加入體積體積分?jǐn)?shù)為54%的乙醇，混勻，于微波功率500 W，微波溫度70 ℃，微波處理5 min后再在超聲功率440 W、超聲時(shí)間5 min條件下提取。將提取液8 000 r/min離心10 min，取上清以70%乙醇定容后，加入4倍體積的95%乙醇，靜置24 h后，以沉淀多糖、蛋白質(zhì)等。之后濃縮過濾，使用葡聚糖凝膠G-10 進(jìn)行分離純化，純化條件為：洗脫液為去離子水，上樣量為2 mL，洗脫速度為1.5 mL/min。即得麥角硫因提取液(部分提取液冷凍干燥后低溫保藏備用)。

將麥角硫因提取液過0.22 μm微孔濾膜后采用高效液相色譜法測定麥角硫因提取量。色譜柱為Phenomenex公司生產(chǎn)，型號(hào)Luna? 5 μm C18(2) 100A，大小250 mm×4.6 mm，貨號(hào)為00G-4252-E0；流動(dòng)相為V(水)∶V(甲醇)=98∶2，流速1 mL/min，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL。上述條件下檢測出麥角硫因提取純度約為22.7%。

1.3.2 麥角硫因的體外抗氧化活性檢測

1.3.2.1 羥自由基清除能力的測定

參考FRANZONI等[17]的方法并略作改動(dòng)。取2.056 5 mL麥角硫因提取液，依次加入0.6 mL 4 mmol/L KH2PO4-KOH緩沖液、43.5 μL 3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2和各75 μL的4 mmol/L EDTA、0.8 mmol/L FeCl3、4 mmol/LL-抗壞血酸、112 mmol/L脫氧核糖。37 ℃水浴1 h后，添加等體積的0.6%硫代巴比妥酸溶液，沸水浴反應(yīng)20 min，立即冰浴降溫，6 000 r/min離心分離得上清。測定波長為600 nm，532 nm，450 nm波長。用式(1)表示反應(yīng)中產(chǎn)生的MDA濃度，用式(2)計(jì)算羥自由基清除能力(%)：

Q/(μmol·L-1) = 6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(1)

(2)

式中：Q為MDA濃度,μmol/L；Q1為對(duì)照管測定的MDA濃度，μmol/L；Q2為待測樣品管測定的MDA濃度，μmol/L；Q3為誤差管測定的MDA濃度，μmol/L。

1.3.2.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考ZHANG等[18-19]的方法并略作修改。向1 mL麥角硫因提取液中添加3倍體積的100 μmol/L的DPPH-甲醇溶液，黑暗條件靜置35 min，檢測波長為517 nm。 使用蒸餾水代替提取液作對(duì)照，以純甲醇代替DPPH自由基溶液為誤差。DPPH自由基清除能力用式(3)計(jì)算。

(3)

式中：OD0表示對(duì)照管OD值；ODi表示測定管OD值；ODj表示誤差管OD值。

1.3.2.3 ABTS自由基清除能力的測定

參考THAIPONG等[20]的方法并略加修改。取ABTS儲(chǔ)備液(4.9 mmol/L過硫酸鉀水溶液和14 mmol/L ABTS水溶液等體積混勻，25 ℃黑暗反應(yīng)12～16 h即可)加入等體積48%乙醇稀釋至OD734= 0.650±0.02。向3.9 mL稀釋液添加0.1mL麥角硫因提取液，渦旋45 s，25 ℃反應(yīng)7 min。測定波長為734 nm。以等量70%乙醇代替提取液為對(duì)照，以等體積蒸餾水代替ABTS工作液為誤差。按照式(4)計(jì)算ABTS自由基清除能力。

(4)

式中：A1表示對(duì)照管吸光值；A2表示待測樣品管吸光值；A3表示誤差管吸光值。

1.3.2.4 FRAP法

參考THAIPONG等[20]的方法并略加修改。FRAP工作液(0.3 mol/L pH 3.2醋酸鈉緩沖液，20 mmol/L FeCl3溶液和12 mmol/L三吡啶基三嗪溶液以體積比10∶1∶1混勻即得)。取3 mL工作液于37 ℃下避光水浴至恒溫后，加入100 μL杏鮑菇麥角硫因提取液，測定波長為593 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線以FeSO4溶液(200～1 000 μmol/L)代替提取液測定吸光度值，結(jié)果表示為每毫升樣品液達(dá)到同樣吸光度所需的Fe2+的濃度(μmol/L)表示。

1.3.3 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉的保鮮作用

1.3.3.1 新鮮魚肉前處理

采購新鮮活鳙魚，宰殺后洗凈絞碎后將肉糜隨機(jī)分成6組。設(shè)置第1組為對(duì)照(保鮮劑以同體積蒸餾水代替)，第2～5組為麥角硫因處理組(具體為ERG×0、ERG×1、ERG×2和ERG×3，數(shù)字代表稀釋倍數(shù))，其中ERG×0組使用的麥角硫因濃縮液是2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的提取凍干粉溶液，第6組為TBH組(保鮮劑為叔丁基對(duì)苯二酚，添加量同ERG×0組)。每組均按照1 mL/100 g的保鮮劑添加量和2%添加量的食鹽添加量添加相應(yīng)保鮮劑和食鹽，混勻后將各組肉糜均分為約30 g的小份，制成厚度為1.0 cm、直徑約7.0 cm的肉餅，密封袋封裝后于4 ℃冰箱貯藏3 d。每天隨機(jī)取樣并分別檢測以下指標(biāo)以分析杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉的保鮮效果。

1.3.3.2 色差值檢測

根據(jù)操作說明使用色差計(jì)進(jìn)行色差值測定，使用黑白板校正。

1.3.3.3 pH值檢測

參照國標(biāo)GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》測定貯藏肉餅的pH值。

1.3.3.4 羰基含量檢測

取肉餅1.0 g于pH 7.4的磷酸緩沖液(15 mL)中均質(zhì)過濾。濾液(0.5 mL)用等體積的10%TCA處理后離心分離沉淀，再經(jīng)等體積鹽酸-丙酮(鹽酸體積分?jǐn)?shù)為3%)溶液洗滌3次后，以1 mL蒸餾水溶解即得待測樣品液。以2 mol/L鹽酸作空白。待測樣品液先與等體積10 mmol/L DNPH-HCL溶液于25 ℃避光反應(yīng)1 h，再經(jīng)20% TCA處理后12 000 r/min離心分離沉淀。以乙醇-乙酸乙酯(體積分?jǐn)?shù)為50%)溶液洗滌3次后，再將沉淀重新于37 ℃在3 mL鹽酸胍溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用) 中溶解 15 min，室溫12 000 r/min離心3 min取上清。測定波長為370 nm。根據(jù)測得的吸光度計(jì)算魚肉中的羰基含量。

1.3.3.5 硫代巴比妥酸反應(yīng)值檢測

先以5 mL TCA溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)處理均質(zhì)后的1 g肉餅20 min，再與等體積的TBA溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%)于沸水浴中反應(yīng)30 min。立即冰浴降溫終止反應(yīng)。用等體積正丁醇洗滌1次，于5 000 r/min離心分離得上清。測定波長為600 nm和532 nm。計(jì)算硫代巴比妥酸反應(yīng)值。

1.3.3.6 貯藏魚肉感官評(píng)定

邀請(qǐng)具備評(píng)定能力和專業(yè)知識(shí)的8名感官評(píng)定員，參照魚肉感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)表4，對(duì)處理后的貯藏魚肉進(jìn)行感官評(píng)定,如表1。

表1 魚肉感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 Sensory evaluation standard of Pleurotus eryngii on fresh fish during storage

1.3.4 杏鮑菇麥角硫因體外抗氧化能力穩(wěn)定性分析

1.3.4.1 pH對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力穩(wěn)定性的影響

取杏鮑菇麥角硫因提取液(pH=7.8±0.2)0.5 mL，分管添加等體積pH為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0的磷酸鉀緩沖溶液(配制時(shí)以磷酸和氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH)，混勻后在37 ℃水浴孵育2 h。按照1.3.2.2方法測定各管DPPH自由基清除能力。

1.3.4.2 不同溫度對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響

取1 mL杏鮑菇麥角硫因提取液(pH=7.8±0.2)，分管于4、37、50、70、90 ℃孵育1 h，降溫后按照1.3.2.2方法測定各管DPPH自由基清除能力。

1.3.4.3 不同金屬離子對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響

取杏鮑菇麥角硫因提取液(pH=7.8±0.2)0.5 mL，分管添加等體積50 μg/mL的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Al3+溶液，混勻后37 ℃孵育處理1h。各管DPPH自由基清除能力測定方法同1.3.2.2。

1.3.4.4 不同還原劑對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響

取杏鮑菇麥角硫因提取液(pH=7.8±0.2)0.5 mL，分管添加等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 和0.5%的亞硫酸鈉水溶液，37 ℃孵育處理15 min。 按照1.3.2.2方法測定各管DPPH自由基清除能力。

1.3.4.5 不同氧化劑對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響

取杏鮑菇麥角硫因提取液(pH=7.8±0.2)0.5 mL，分管分別添加體積分?jǐn)?shù)為0.00%、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的20% H2O2，混勻后黑暗靜置30 min。按照1.3.2.2方法測定各管DPPH自由基清除能力。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

本文使用Excel 2016和SPSS 22 進(jìn)行顯著性分析，Origin 8.5等圖表制作軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇麥角硫因的體外抗氧化活性分析

2.1.1 羥自由基清除能力

金屬依賴型羥自由基可降解脫氧核糖。作為其降解反應(yīng)的產(chǎn)物之一，丙二醛(MDA)的濃度可間接說明抗氧化劑的羥自由基清除能力的強(qiáng)弱[17]。本研究據(jù)此來檢測麥角硫因的抗氧化性，并使用谷胱甘肽(傳統(tǒng)抗氧化劑)作為對(duì)照分析。

如圖1所示，添加量對(duì)2種抗氧化劑的抗氧化活性影響顯著，且在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度梯度區(qū)間內(nèi)，相較于谷胱甘肽，杏鮑菇麥角硫因(ERG)的羥自由基清除能力顯著更強(qiáng)(P<0.05)；0.262 mmol/L的谷胱甘肽羥自由基清除率最高僅為22.2%，而麥角硫因(ERG)最高可至64.26%。這表明杏鮑菇麥角硫因的羥自由基清除能力較谷胱甘肽顯著更強(qiáng)、且與杏鮑菇麥角硫因濃度(添加量)呈正相關(guān)。FRANZONI等也發(fā)現(xiàn)，和抗壞血酸、生育酚、谷胱甘肽等常見抗氧化劑相比，L-麥角硫因(Mw=229.3) 清除過氧自由基和羥自由基等效果更好[17]。

圖1 麥角硫因的羥自由基清除能力Fig.1 Hydroxyl free radical scavenging ability of ergothioneine

2.1.2 DPPH自由基清除能力

作為一種比較穩(wěn)定的自由基，DPPH自由基可與抗氧化劑的單電子結(jié)合導(dǎo)致褪色。其褪色強(qiáng)弱與抗氧化劑的抗氧化能力直接相關(guān)[19]。如圖2所示，在0.087～0.436 mmol/L，杏鮑菇麥角硫因濃度和其DPPH清除能力顯著正相關(guān)(r2=0.981，P<0.05)，BHATTACHARYA等的研究也發(fā)現(xiàn)平菇(Pleurotusostreatus)麥角硫因含量與其DPPH自由基清除能力存在正相關(guān)關(guān)系(r2=0.94)[21]；在0.349～0.872 mmol/L的麥角硫因的DPPH自由基清除能力始終位于抗壞血酸和谷胱甘肽之間，且當(dāng)濃度增加至0.523～1.047 mmol/L時(shí)，杏鮑菇麥角硫因的DPPH自由基清除能力穩(wěn)定在96%左右。這表明杏鮑菇麥角硫因是很好的DPPH自由基清除劑，且整體DPPH自由基清除能力強(qiáng)于谷胱甘肽。這與ZHANG等的研究也表明1-麥角硫因含量較高的黃色金針菇(Flammulinavelutipes)的提取物在DPPH自由基，羥自由基清除力中表現(xiàn)出更好的抗氧化活性[22]。

圖2 麥角硫因的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of ergothioneine

2.1.3 ABTS自由基清除能力

ABTS自由基在抗氧化劑存在下的減少程度可用于評(píng)估可被抗氧化劑清除的自由基總量，反映了抗氧化劑的抗氧化能力強(qiáng)弱[20]。如圖3所示，在濃度0.087～0.349 mmol/L，杏鮑菇麥角硫因的ABTS清除能力始終位于抗壞血酸和谷胱甘肽之間(P<0.05)。

圖3 麥角硫因的ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS free radical scavenging ability of ergothioneine

有趣的是，抗壞血酸和谷胱甘肽的ABTS自由基清除能力增加到一定程度后出現(xiàn)穩(wěn)定平緩的趨勢，而杏鮑菇麥角硫因的ABTS自由基清除能力始終增強(qiáng)至最大，沒有出現(xiàn)最高穩(wěn)定范圍。在濃度為1.047 mmol/L時(shí)，盡管較其他2種傳統(tǒng)抗氧化劑，杏鮑菇麥角硫因的ABTS自由基清除力顯著最弱(P<0.05)，但仍能達(dá)到89.28%，且有繼續(xù)上升的趨勢。GHAHREMANI-MAJD等比較了雙孢蘑菇子實(shí)體和其不同生長期的菌絲提取物中的麥角硫因含量和ABTS自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)在麥角硫因含量最高的S1菌株子實(shí)體提取物的ABTS自由基清除能力最高，而麥角硫因含量最低的S4初期菌絲提取物的ABTS自由基清除能力最低[23]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測隨著濃度的繼續(xù)上升，杏鮑菇麥角硫因的ABTS自由基清除力仍會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，且可能增強(qiáng)至抗壞血酸和谷胱甘ABTS自由基清除力的最高值。

2.1.4 FRAP抗氧化能力檢測

在抗氧化物質(zhì)的作用下， Fe3+被還原成Fe2+，因此通過檢測Fe2+-TPTZ的生成量(FRAP值)可以反映抗氧化物質(zhì)的還原能力[20]。如圖4所示，在0.087～1.047 mmol/L，抗壞血酸和谷胱甘肽的FRAP抗氧化能力均隨著其濃度的增加而顯著增強(qiáng)，但杏鮑菇麥角硫因的FRAP抗氧化能力的增強(qiáng)并不顯著(P>0.05)。圖4還表明，杏鮑菇麥角硫因的FRAP值在圖示濃度區(qū)間內(nèi)始終顯著低于抗壞血酸和谷胱甘肽(P<0.05)，且維持在0.056 3～0.072 3 μmol/L，接近于0，顯示出極弱的FRAP抗氧化能力。這可能是因?yàn)榇藴y定環(huán)境(酸性)嚴(yán)重影響了麥角硫因的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其FRAP抗氧化能力的丟失。KIM等也發(fā)現(xiàn)平菇麥角硫因最高FRAP抗氧化力(8.86±0.33 FeSO4eq)遠(yuǎn)低于其最高DPPH自由基和ABTS自由基清除活性，分別為(80.41±0.56)%和(91.47±0.11)%[24]。

圖4 麥角硫因的FRAP值Fig.4 FRAP of ergothioneine

2.2 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉的保鮮作用

2.2.1 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉的護(hù)色作用

色差值(a*)越低，魚肉顏色越暗，細(xì)胞受損和脂肪氧化就越嚴(yán)重。如圖5所示，在0～3 d的貯藏期內(nèi)，對(duì)照組的色差值都較低，第3天時(shí)，在所有組中顯著最低(P<0.05)；在3 d的貯藏期，ERG×0組的色差值較高且保持穩(wěn)定，且其第1天色差值在所有處理組中最高(P<0.05)；而在第0、2、3天，ERG×2組的色差值顯著最高(P<0.05)。ENCARNACION等研究發(fā)現(xiàn)金針菇提取物中的麥角硫因可與黑變關(guān)鍵酶之一的酚氧化酶上的金屬銅離子螯合，導(dǎo)致此黑變關(guān)鍵酶活性降低，從而有效抑制成年黑虎蝦和太平洋白對(duì)蝦的黑變病[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉的護(hù)色作用明顯，且效果優(yōu)于傳統(tǒng)保鮮劑TBH。本實(shí)驗(yàn)還表明杏鮑菇麥角硫因的護(hù)色效果受濃度和貯藏時(shí)間影響，貯藏前期高濃度的麥角硫因護(hù)色效果最好，貯藏后期中等濃度的麥角硫因效果最佳。

圖5 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉的護(hù)色作用Fig.5 Color protection effect of ergothioneine on the fresh fish during storage

2.2.2 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉pH值的維持作用

如圖6所示，第0～1天所有組的pH值顯著下降(P<0.05)，這是魚肉在貯藏初期三磷酸腺苷和糖原分解產(chǎn)生磷酸、乳酸等酸性物質(zhì)所致；第1～3天所有組的pH值呈上升趨勢，這是因?yàn)樵谫A藏后期，魚肉發(fā)生酶促等自身溶解反應(yīng)，如蛋白質(zhì)分解，TMAO分解和AMP脫氨等，產(chǎn)生氨基酸、TMA和DMA等含氮堿性化合物，導(dǎo)致魚肉pH值上升，品質(zhì)下降。

圖6 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉pH變化的作用Fig.6 Effect of ergothioneine on the pH change of fresh fish during storage

第0～1天，ERG×3組pH值減幅最低，這說明貯藏前期低濃度的麥角硫因更有利于魚肉pH值的維持；在第1～3天，ERG×0組pH值增幅最高。3 d后ERG×0組的pH值最高(P<0.05)，ERG×2組次之，對(duì)照組pH值水平居中，TBH組pH最低(P<0.05)。這些結(jié)果表明貯藏后期較高濃度的杏鮑菇麥角硫因更能有效維持新鮮魚肉的pH，且總體的pH維持效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)保鮮劑TBH。

2.2.3 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉蛋白質(zhì)氧化的減緩作用

自由基被氧化的一個(gè)重要特征是羰基的形成，據(jù)此蛋白質(zhì)的氧化程度可由羰基含量的變化來評(píng)判[26-27]。如圖7所示，在整個(gè)貯藏期內(nèi)，對(duì)照組的羰基含量始終較麥角硫因組和TBH組高，且所有組的羰基含量均顯著上升(P<0.05)，表明隨著貯藏時(shí)間的延長，魚肉中的蛋白質(zhì)被迅速氧化。第2天和第3天時(shí)，麥角硫因處理組和TBH組的羰基含量均低于對(duì)照組，這說明杏鮑菇麥角硫因和TBH均能在一定程度上抑制魚肉的蛋白質(zhì)氧化。第3天時(shí)，貯藏魚肉羰基含量高低順序?yàn)镋RG×1組

圖7 杏鮑菇麥角硫因?qū)π迈r魚肉貯藏過程羰基含量變化的作用Fig.7 Effect of ergothioneine on changes of carbonyl content of fresh fish during storage

2.2.4 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉脂肪氧化的減緩作用

在貯藏后期，酶解和自動(dòng)氧化可導(dǎo)致細(xì)胞脂肪氧化，而脂肪氧化產(chǎn)生醛類物質(zhì)可與硫代巴比妥酸生成有色化合物，因此硫代巴比妥酸反應(yīng)值越高，脂肪氧化就越嚴(yán)重[3]。如圖8所示，整個(gè)貯藏期內(nèi)，對(duì)照組的硫代巴比妥酸反應(yīng)值顯著最高，脂肪氧化最嚴(yán)重；TBH組的硫代巴比妥酸反應(yīng)值顯著最低(P<0.05)，脂肪氧化程度最輕，這說明傳統(tǒng)保鮮劑TBH具有最強(qiáng)的抑制脂肪氧化效果。4個(gè)麥角硫因處理組的硫代巴比妥酸反應(yīng)值較TBH組較高，但較對(duì)照組低，脂肪氧化程度顯著較輕(P<0.05)。PAHILA等研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充富含麥角硫因的金針菇提取物能有效降低低溫貯藏的鮭魚中脂質(zhì)過氧化氫(HPO)的積累，進(jìn)而減緩其脂質(zhì)氧化程度[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明杏鮑菇麥角硫因具有一定的減緩脂肪氧化能力，但同等濃度下抗脂肪氧化效果較TBH更弱。

圖8 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉硫代巴比妥酸值變化的作用Fig.8 Effect of ergothioneine on changes of TBA of fresh fish during storage

2.2.5 杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉感官品質(zhì)的維持作用

感官評(píng)定是對(duì)食品品質(zhì)評(píng)判的一個(gè)基礎(chǔ)的手段，其結(jié)果是消費(fèi)者選購食品的主要依據(jù)。如表2所示，第0天的魚肉為粉紅色，色澤明亮均勻，有鮮味，無異味和酸敗味，總體品質(zhì)可接受程度高；第1天時(shí)，所有處理組肉樣顏色都較第0天加深，魚腥味加重，但4個(gè)麥角硫因處理組魚腥味最淡；至冷藏第2天，肉樣顏色較前1天無明顯差異(P>0.05)，但對(duì)照組和TBH組均出現(xiàn)強(qiáng)烈酸腐味，且ERG×0組酸腐味最淡。第3天時(shí)，所有組變味顯著，酸腐味明顯，肉質(zhì)變軟，且伴隨著淺褐色組織液的溶出，但麥角硫因處理組的酸腐味和淺褐色組織液溶出的程度較另外2組顯著較輕。這些結(jié)果說明，杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉的酸腐變味有顯著的減緩作用，可有效延長新鮮魚肉的冷藏期，且效果較傳統(tǒng)保鮮添加劑TBH更強(qiáng)。CAI等的研究也表明麥角硫因-殼聚糖涂膜比只有殼聚糖涂膜處理能更好地抑制日本鱸魚總揮發(fā)性堿性氮的增加、保持魚肉組織硬度和減少生物胺含量(尤其是腐胺，尸胺和組胺)等刺激性氣體的產(chǎn)生，延長其保質(zhì)期[30]。

添加抗氧化劑是貯存食品的有效手段之一。而過量攝入人工合成抗氧化劑引起的潛在毒性、致癌作用及可能的健康損害已被越來越多的研究證實(shí)[31]。例如，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，食用過量的傳統(tǒng)保鮮添加劑TBH會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生負(fù)面影響，存在患胃腫瘤和損傷脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA) 的風(fēng)險(xiǎn)[32]。消費(fèi)者對(duì)這些人工合成抗氧化劑劑安全性的擔(dān)憂促使食品工業(yè)尋找天然抗氧化劑，以代替其在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用[31]。研究發(fā)現(xiàn)麥角硫因或富含麥角硫因的蘑菇提取物可有效減緩鮭魚[29]、日本鱸魚[30]和紅鯛(Pagrosomusmajor)[33]等貯藏魚肉的變色、酸敗、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化等品質(zhì)劣變，延長其貨架期。但受其來源和產(chǎn)量的制約，麥角硫因在魚肉保鮮的應(yīng)用目前仍停留于研究階段。本保鮮實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明相較于人工合成保鮮劑TBH，杏鮑菇麥角硫因?qū)A藏魚肉總體保鮮效果較好，表現(xiàn)出更好的護(hù)色、維持pH、減緩蛋白質(zhì)氧化及酸敗腐變等作用，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較高。

表2 貯藏魚肉感官評(píng)定結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of fresh fish during storage

注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.3 杏鮑菇麥角硫因的體外抗氧化能力穩(wěn)定性分析

2.3.1 pH對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響

如圖9所示，環(huán)境pH對(duì)杏鮑菇麥角硫因的DPPH自由基清除能力的影響差異顯著(P<0.05)。在強(qiáng)酸性條件下(pH為2或4)時(shí)，杏鮑菇麥角硫因的DPPH自由基清除能力接近0；在弱堿性條件下(pH為6～8)時(shí)，麥角硫因DPPH自由基清除能力顯著增強(qiáng)；當(dāng)pH高于8時(shí)，麥角硫因DPPH自由基清除能力維持在80%左右不變。

圖9 pH對(duì)麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響Fig.9 Effect of pH on DPPH free radical scavenging capacity of ergothioneine注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

這些結(jié)果表明中性和堿性環(huán)境更有利于維持麥角硫因DPPH自由基清除能力穩(wěn)定性，而酸性環(huán)境則會(huì)顯著降低其體外抗氧化力的穩(wěn)定性(P<0.05)。這一結(jié)果與本研究在上述抗氧化活性FRAP試驗(yàn)結(jié)果相一致。CUMMING等也發(fā)現(xiàn)與谷胱甘肽和抗壞血酸不同，麥角硫因在生理pH下以硫酮形式存在，不存在自氧化作用，因而具有更高效的抗氧化性和穩(wěn)定性[6]。

2.3.2 不同溫度影響杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力

圖10表明不同溫度培育對(duì)杏鮑菇麥角硫因的DPPH自由基清除能力的影響差異不顯著(P>0.05)。4 ℃恒溫培育的麥角硫因DPPH自由基清除能力最弱，為 78.64%；其次為37℃培育的麥角硫因，為80.82%；90 ℃ 培育的麥角硫因DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，為 82.34%。這些結(jié)果表明杏鮑菇麥角硫因在37℃人體溫度和90 ℃高溫下均具有良好的穩(wěn)定性，其提取和應(yīng)用等都可在這些溫度下進(jìn)行。這也和ITO等的實(shí)驗(yàn)也表明在高溫下提取的麥角硫因仍有較好的抗氧化活性[34]。麥角硫因在人體溫度和生理pH具有較強(qiáng)穩(wěn)定性特征使其在保健品等功能性產(chǎn)品等領(lǐng)域且有極高的應(yīng)用價(jià)值。

圖10 溫度對(duì)麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響Fig.10 Effect of temperature on DPPH free radical scavenging capacity of ergothioneine

2.3.3 金屬離子對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響

圖11表明金屬離子的存在會(huì)顯著降低杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力(P<0.05)。和對(duì)照組相比，添加金屬離子使杏鮑菇麥角硫因的DPPH自由基清除能力整體直接減少24.76%～32.06%。圖11還表明，各金屬離子對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響存在差異但不顯著(P>0.05)。金屬離子存在時(shí)麥角硫因DPPH自由基清除能力穩(wěn)定性從小到大依次為K+< Mg2+< Na+< Al3+< Ca2+< Fe3+。其中K+和Mg2+對(duì)麥角硫因穩(wěn)定性的影響最大，分別使其DPPH自由基清除能力降低了39.75%和35.81%；Ca2+和Fe3+的存在對(duì)其穩(wěn)定性的影響較小，分別使其DPPH自由基清除能力降低了32.48%和30.73%。 ZHU等研究發(fā)現(xiàn)麥角硫因(Sigma)能與Cu(I)形成一種穩(wěn)定的無氧化還原性的復(fù)合物[28]，因此推測這些金屬離子可能也會(huì)與杏鮑菇麥角硫因結(jié)合導(dǎo)致其DPPH自由基清除能力的顯著降低。這表示在麥角硫因的制備、保存和應(yīng)用中應(yīng)該盡量避免其與金屬離子共存，特別是K+和Mg2+。

圖11 金屬離子對(duì)麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響Fig.11 Effect of metal ions on DPPH free radical scavenging capacity of ergothioneine注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.3.4 還原劑對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響

圖12表明亞硫酸鈉的添加使麥角硫因的DPPH自由基清除能力急劇下降。這說明，亞硫酸鈉(還原劑)的存在能顯著降低杏鮑菇麥角硫因的穩(wěn)定性，其微量添加即會(huì)使麥角硫因的DPPH自由基清除能力急劇減弱，在麥角硫因的提取、保存和使用過程中應(yīng)嚴(yán)格避免其與亞硫酸鈉等還原劑接觸。

圖12 還原劑對(duì)麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響Fig.12 Effect of reducing agent on DPPH free radical scavenging capacity of ergothioneine

2.3.5 氧化劑對(duì)杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除力的影響

如圖13所示，隨著H2O2(氧化劑)添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的增大，杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除能力持續(xù)下降，這說明杏鮑菇麥角硫因的穩(wěn)定性受到環(huán)境中H2O2(氧化劑)存在的顯著影響。因此，在麥角硫因的提取、保存和使用過程中應(yīng)有意識(shí)地減少其與H2O2等氧化劑接觸。值得注意的是，當(dāng)H2O2添加量為0.1%時(shí)，杏鮑菇麥角硫因DPPH自由基清除率為36.07%，遠(yuǎn)大于等量添加亞硫酸鈉(還原劑)時(shí)其DPPH自由基清除率(1.57%)，這表明H2O2對(duì)杏鮑菇麥角硫因的穩(wěn)定性的影響較亞硫酸鈉(還原劑)弱。

圖13 氧化劑對(duì)麥角硫因DPPH自由基清除能力的影響Fig.13 Effect of oxidants on DPPH free radical scavenging capacity of ergothioneine

3 結(jié)論

添加量對(duì)麥角硫因的抗氧化活性影響顯著，在一定區(qū)間內(nèi)表現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢。同等添加量下，相比于抗壞血酸和谷胱甘肽，杏鮑菇麥角硫因的抗氧化活性表現(xiàn)出顯著最強(qiáng)的羥自由基的清除能力(P<0.05)， 位于二者之間的DPPH自由基清除能力，較弱的ABTS自由基清除能力和顯著最低的FRAP抗氧化能力(P<0.05)。相較于人工合成保鮮劑TBH，杏鮑菇麥角硫因不僅具有更高的天然安全性，且對(duì)貯藏魚肉總體保鮮效果較好，表現(xiàn)出更好的護(hù)色、維持pH、減緩蛋白質(zhì)氧化及酸敗腐變等作用，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較高。穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，酸性、K+/Mg2+類金屬離子、部分氧化劑和還原劑等環(huán)境因子可顯著降低杏鮑菇麥角硫因的體外抗氧化活性,而人體溫度37 ℃/較高溫度(如90 ℃)、生理pH/強(qiáng)堿等條件則有利于其穩(wěn)定性的維持。本文證實(shí)杏鮑菇麥角硫因具有較強(qiáng)體外抗氧化性和保鮮效果，并對(duì)影響麥角硫因抗氧化能力穩(wěn)定性的環(huán)境條件進(jìn)行初探，可為其在各領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。