張穎，張光艷，王宇翔，曹煒

(西北大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安，710069)

蜂蜜是大自然賜予人類的珍貴禮品，富含葡萄糖、果糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素及酚類等多種營養(yǎng)物質(zhì)，在抑菌、抗氧化、提高免疫力、抗突變和消炎等方面具有獨(dú)特的生理功能[1-3]。我國是世界蜂蜜生產(chǎn)大國，洋槐蜜、荊條蜜、油菜蜜、棗花蜜、龍眼蜜等大宗單花種蜂蜜深受國內(nèi)外消費(fèi)者青睞。然而，現(xiàn)行蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)中缺乏有效區(qū)分蜂蜜花源的內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)，受利益因素驅(qū)使，在商品價(jià)值較高蜂蜜品種中摻入廉價(jià)蜂蜜的現(xiàn)象普遍存在[4-5]。因此，亟需加強(qiáng)對(duì)蜂蜜花源鑒別技術(shù)和方法的研究開發(fā)。

蜂蜜中約含有0.02%～0.5%蛋白質(zhì)，近年來國內(nèi)外一些研究表明，蛋白質(zhì)可以作為蜂蜜中的特征內(nèi)標(biāo)成分，用來鑒別蜂蜜的花源、蜂種以及地理源[6-11]。IGLESIAS等采用快速蛋白質(zhì)液相色譜分析西班牙花蜜和甘露蜜，發(fā)現(xiàn)兩類蜂蜜中存在特有的蛋白色譜峰[7]。SONG等通過研究枇杷蜜與油菜蜜中植物源幾丁質(zhì)酶活性的差異，認(rèn)為植物源幾丁質(zhì)酶可作為潛在的蛋白標(biāo)志分子來識(shí)別枇杷蜜[9]。鄧建軍等分析了蕎麥蜜和摻假蕎麥蜜SDS-PAGE圖譜的差異，認(rèn)為從蛋白質(zhì)角度可為鑒別蜂蜜真?zhèn)伍_辟一條新途徑[11]。然而目前相關(guān)研究主要針對(duì)國外蜂蜜品種，有關(guān)中國各種特色蜂蜜中的蛋白質(zhì)組成差異以及特征標(biāo)識(shí)蛋白研究尚處于起步階段。

因此，本文以棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜為研究對(duì)象，首先通過考馬斯亮藍(lán)和銀氨2種染色方法比較不同花源蜂蜜蛋白質(zhì)電泳行為的差異；然后采用超濾法和硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白質(zhì)，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和反相高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)分析2種蛋白質(zhì)提取方法的適用性和分離效果，以期為探尋中國特色蜂蜜中蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)物、構(gòu)建蜂蜜花源溯源和質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種蜂蜜樣品信息：棗花蜜采自陜西佳縣(2016年)、荊條蜜采自河南輝縣(2013年)、龍眼蜜采自廣東茂名(2012年)、土蜂蜜采自陜西漢中(2015年)、洋槐蜜采自甘肅清水(2017年)、油菜蜜采自陜西漢中(2014年)，所有蜂蜜從蜂場采集、運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后于4 ℃保存待用。

低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker(14.4～97.4kDa)，北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白(純度≥99%)，美國Amresco公司；考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250、丙烯酰胺、N,N-亞甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基甲烷、甘氨酸，西安科昊生物工程有限公司；鎢酸鈉、三氟乙酸(色譜級(jí))、乙腈(色譜級(jí))、AgNO3、Na2CO3、乙二胺四乙酸二鈉，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子分析天平(精度0.1 mg)，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；TGL-16G高速冷凍離機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；722G可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；8 400超濾杯，美國Millipore公司；Five easy plus pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DYCZ-24雙垂直蛋白電泳儀，北京六一儀器廠；FD-1冷凍干燥機(jī)，西安予輝儀器有限公司；U-3000高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蜂蜜蛋白質(zhì)含量[12]。100 μL不同濃度牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液與5 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液中混勻，室溫下反應(yīng)5 min，使用紫外/可見分光光度計(jì)于595 nm處測(cè)定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5 g蜂蜜溶于5 mL去離子水中，4 500 r/min下離心10 min，吸取100 μL上清液與5 mL考馬斯亮藍(lán)液中混勻，室溫下反應(yīng)5 min，于595 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)吸光值計(jì)算蜂蜜蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 超濾法提取蜂蜜蛋白質(zhì)

參考WON等[13]方法對(duì)蜂蜜中蛋白進(jìn)行超濾分離。90 g蜂蜜溶于90 mL去離子水，混勻后于4 500 r/min下離心10 min，收集上清液，置于截留分子質(zhì)量3 500 Da透析袋中透析4次，透析結(jié)束后經(jīng)5 000 Da濾膜超濾濃縮，收集濃縮蜂蜜蛋白液，然后真空干燥成凍干粉，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白質(zhì)

參考AOAC方法[14]采用硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白。12 g蜂蜜于50 mL離心管中，加入4 mL去離子水混勻，將2 mL 100 mg/mL鎢酸鈉溶液和2 mL 0.335 mol/L H2SO4溶液迅速混勻后，加到蜂蜜樣品離心管中混勻，然后80 ℃水浴30 min，水浴過程中每隔5 min旋轉(zhuǎn)離心管30 s，不斷有絮狀沉淀析出。水浴結(jié)束后，用水反復(fù)洗滌沉淀物5次，倒去上清液，將蜂蜜蛋白沉淀真空干燥成凍干粉，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 蜂蜜蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析

對(duì)于蜂蜜樣品，6 g蜂蜜與去離子水1∶1混勻，進(jìn)行或不進(jìn)行離心處理(離心參數(shù)：4 500 r/min離心10 min)， 取上清液備用；對(duì)于超濾法和鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白，稱取蜂蜜蛋白粉0.1 g溶于2 mL去離子水備用。電泳參考CHEVALLET等方法[15]進(jìn)行，采用4%濃縮膠和12%分離膠，將蜂蜜或蜂蜜蛋白溶液與樣品緩沖液1∶1混合，沸水加熱3～5 min，迅速冷卻至室溫，然后上樣20 μL，Marker上樣10 μL。 凝膠電泳電壓開始設(shè)定為80 V，待進(jìn)入分離膠后調(diào)整為120 V，電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R250染色或銀氨染色，終止顯色后拍照。

1.3.5 蜂蜜蛋白質(zhì)RP-HPLC分析

分別稱取0.25 g超濾法和0.1 g鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白粉溶于1 mL超純水，然后過0.45 μm濾膜，參考ZHANG等方法[16]并適當(dāng)修正進(jìn)行RP-HPLC分析。色譜條件：色譜柱：C18，5 μm，250 mm×4.6 mm i.d，80 ?；流動(dòng)相A：含0.1%三氟乙酸的水；流動(dòng)相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈；進(jìn)樣量：20 μL； 流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：215 nm；檢測(cè)溫度：30 ℃；洗脫程序：0～5 min B為10%；5～40 min B從10%到80%；40～50 min B從80%到10%；50～60 min B為10%；60 min停止。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，且P<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花源蜂蜜蛋白質(zhì)含量的比較

如表1所示，6種不同花源蜂蜜中蛋白質(zhì)含量分布在395.49～944.51 mg/kg，按照含量高低依次為棗花蜜(944.51±38.04)mg/kg、龍眼蜜(801.37±15.49)mg/kg、土蜂蜜(609.22±18.04)mg/kg、洋槐蜜(528.82±65.10)mg/kg、油菜蜜(432.75±20.20)mg/kg、荊條蜜(395.49±12.75)mg/kg。很多研究顯示蜂蜜中約含有0.1%～0.5%蛋白質(zhì)，但這些通常是采用凱氏定氮法通過測(cè)定蜂蜜總氮含量計(jì)算得到，但蜂蜜中總氮僅有40%～80%來自蛋白質(zhì)成分，其余則來自游離氨基酸，因此通過凱氏定氮法測(cè)定蜂蜜蛋白質(zhì)含量會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)比實(shí)際值偏高[17-18]。蜂蜜中蛋白質(zhì)組分有兩類來源：一類是來自于蜜源植物的花粉、花蜜以及滲出物，另一類則來自蜜蜂自身分泌物[19-20]。6種不同花源蜂蜜的蛋白質(zhì)含量在種類間差異顯著(表1)，這可能是由于不同蜜源植物花蜜或花粉中所含蛋白質(zhì)含量差異造成的。

表1 不同花源蜂蜜中蛋白質(zhì)含量Table 1 Protein content of honeyfrom different floral origin

注：同一行具有不同字母數(shù)據(jù)之間代表顯著差異(P<0.05)。

2.2 不同花源蜂蜜蛋白質(zhì)電泳行為分析

蜂蜜中含有少量的蜜源植物花粉，而花粉是蜂蜜中蛋白質(zhì)成分的一個(gè)重要來源，為了觀察花粉對(duì)蜂蜜蛋白質(zhì)電泳行為是否會(huì)產(chǎn)生影響，電泳前對(duì)蜂蜜樣品分別進(jìn)行離心和不離心預(yù)處理，電泳結(jié)束經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后如圖1-A和1-B所示。由圖1-A和1-B可以看出，離心與否對(duì)蜂蜜蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜影響不明顯，無論是否經(jīng)離心預(yù)處理，6種不同花源蜂蜜中蛋白質(zhì)均主要集中在分子質(zhì)量43～97.4 kDa，然而此區(qū)間高豐度蛋白條帶的分子質(zhì)量和顏色深淺在蜂蜜品種間有明顯區(qū)別；對(duì)于棗花蜜、龍眼蜜和土蜂蜜，在> 97.4 kDa明顯存在一些高分子質(zhì)量蛋白。這說明6種花源蜂蜜中主要蛋白質(zhì)組分有一定相似性，但在組成和含量上存在差異。文獻(xiàn)中已鑒定的蜂蜜蛋白包括蜂王漿主蛋白MRJP-1～5、MRJP-7以及α-葡萄糖苷酶等，其分子質(zhì)量均處于50～80 kDa[20-22]。另外，對(duì)于棗花蜜，分子質(zhì)量約19 kDa處存在1條高豐度蛋白條帶，而在其他5種蜂蜜中并不明顯(圖1-A和1-B)，這可能預(yù)示著此蛋白質(zhì)帶可作為棗花蜜的特征花源標(biāo)識(shí)成分。

除考馬斯亮藍(lán)染色外，銀氨染色也常在電泳中用于蛋白質(zhì)顯色，其作為一種高靈敏度蛋白質(zhì)染色方法，在SDS-PAGE圖譜中可以更清晰地表征蛋白質(zhì)組分的差異和變化。圖1-C顯示的是6種蜂蜜銀染蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜，可以看出，與考染相比，銀染將6種蜂蜜蛋白質(zhì)組分差異更清晰地呈現(xiàn)：除43～97.4 kDa高豐度蛋白，棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜和油菜蜜在31～43 kDa存在豐富的次豐度蛋白，而棗花蜜、龍眼蜜和土蜂蜜中<31 kDa和>97.4 kDa蛋白也被更好顯現(xiàn)出來。由此可知，6種不同花源中國蜂蜜中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量遍布于14.4～97.4 kDa，甚至部分品種在> 97.4 kDa還存在較多的高分子質(zhì)量蛋白。MARSHALL等1987年首次采用銀染SDS-PAGE將澳大利亞蜂蜜中分子質(zhì)量分布于10～150 kDa的19個(gè)蛋白條帶呈現(xiàn)出來[23]。BAUER等采用考染SDS-PAGE研究洋槐蜜、葵花蜜、栗子蜜、森林蜜時(shí)，分布于10.5～72 kDa的多條蛋白帶被檢測(cè)[24]。

比較6種蜂蜜的考染和銀染SDS-PAGE圖譜，棗花蜜考染圖譜中19 kDa附近的單一蛋白帶(圖1-A和1-B)在銀染圖譜上呈現(xiàn)為2個(gè)明顯條帶(圖1-C)，這說明其由2個(gè)分子質(zhì)量非常接近的蛋白組分構(gòu)成；而對(duì)于其他5種蜂蜜，雖在銀染圖譜19 kDa附近也顯現(xiàn)出微弱的蛋白帶，但與棗花蜜相比含量非常低微(圖1-C)。另外，在分子質(zhì)量24 kDa附近，荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜的銀染圖譜中出現(xiàn)明顯蛋白帶，但在棗花蜜中并不明顯(圖1-C)，因此，可利用此蛋白組分應(yīng)用于其他5種蜂蜜尤其是低價(jià)格油菜蜜摻入到棗花蜜中的摻假鑒別。

A和B-考馬斯亮藍(lán)染色，A-離心預(yù)處理、B-不離心預(yù)處理；C-銀氨染色；其中泳道M為Marker，泳道1-6分別為棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜圖1 不同花源蜂蜜蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜Fig.1 The SDS-PAGE profiles of honey protein from different floral origin

2.3 不同花源蜂蜜提取蛋白SDS-PAGE分析

蜂蜜中僅含有痕量蛋白質(zhì)，而其中大量存在的葡萄糖、果糖以及酚酸、黃酮等小分子代謝成分均可能會(huì)干擾蜂蜜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征，采取合適的方法將蜂蜜中蛋白質(zhì)分離出來是準(zhǔn)確全面鑒定蜂蜜蛋白質(zhì)種類的前提[21]。文獻(xiàn)報(bào)道的蜂蜜蛋白質(zhì)提取分離方法主要分為兩類：物理法(超濾、色譜法等)和化學(xué)沉淀法(硫酸-鎢酸鈉、硫酸銨、TCA丙酮法等)，而其中的超濾分離和硫酸-鎢酸鈉沉淀被認(rèn)為是提取蜂蜜蛋白最為有效的2種方法[18,21]。因此，本研究比較分析了超濾法和鎢酸鈉沉淀法分離6種中國蜂蜜蛋白質(zhì)的適用性及效果。

超濾法提取蜂蜜蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜如圖2-A所示，與原始蜂蜜相比(圖1-A)，超濾法有效濃縮了棗花蜜、荊條蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜中高豐度蛋白，在電泳圖譜中表現(xiàn)為43～97.4 kDa的蛋白條帶緊密聚集而不能分開，并且對(duì)<43 kDa甚至是14.4 kDa以下的次豐度蛋白組分也有不等程度富集效果(圖2-A，泳道1、2、4、5和6)。由此可知，超濾法實(shí)現(xiàn)了對(duì)此5種蜂蜜蛋白質(zhì)的有效分離。但對(duì)于龍眼蜜，與原始蜂蜜樣品相比(圖1-A，泳道3)，超濾分離并沒有明顯增加電泳圖譜中蛋白質(zhì)條帶的數(shù)量和含量(圖2-A，泳道3)。

圖2-B顯示的是硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜。與超濾法相比，洋槐蜜、油菜蜜尤其是荊條蜜中43～97.4 kDa高豐度蛋白的含量明顯降低，<43 kDa次豐度蛋白條帶也有一定程度減少(圖2-B，泳道2、5和6)，而棗花蜜SDS-PAGE圖譜中則幾乎沒有明顯的蛋白條帶(圖2-B，泳道1)。這說明硫酸-鎢酸鈉沉淀法對(duì)4種蜂蜜尤其是棗花蜜中蛋白質(zhì)的分離效果差于超濾法。

A-超濾法提取蜂蜜蛋白，B-硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白；其中泳道M為Marker，泳道1-6分別為棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜圖2 不同方法提取蜂蜜蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜Fig.2 The SDS-PAGE profiles of honey protein obtained by different extraction methods

棗花蜜pH在7左右接近中性，而其他5種蜂蜜呈酸性(pH 3～4)，蜂蜜體系酸堿性的差異可能導(dǎo)致硫酸-鎢酸鈉沉淀法不適用于提取棗花蜜蛋白[25]。CHUA等采用超濾法、鎢酸鈉沉淀法、硫酸銨鹽析法分離馬來西亞洋槐蜜、圖朗蜜和吉蘭蜂蜜蛋白質(zhì)時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)超濾法對(duì)3種蜂蜜蛋白質(zhì)的提取效果更佳[21]。然而，對(duì)于土蜂蜜，鎢酸鈉沉淀法提取蛋白雖然沒有超濾法濃度高，但其包含的蛋白質(zhì)分布于泳道各個(gè)分子質(zhì)量段，尤其有效富集了>97.4 kDa的高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)(圖2-B，泳道4)；對(duì)于龍眼蜜，鎢酸鈉沉淀法獲得的蛋白質(zhì)無論從種類還是含量方面，均明顯優(yōu)于超濾法(圖2-B，泳道3)。

由此可見，超濾法和硫酸-鎢酸鈉沉淀法對(duì)6種不同花源中國蜂蜜的蛋白質(zhì)提取效果差異明顯，超濾法適合用來提取棗花蜜、荊條蜜、洋槐蜜和油菜蜜中蛋白質(zhì)，而土蜂蜜和龍眼蜜則更適合用鎢酸鈉沉淀法進(jìn)行。

2.4 不同花源蜂蜜提取蛋白R(shí)P-HPLC分析

反相高效液相色譜利用待分離物質(zhì)的極性差異進(jìn)行分離，可根據(jù)出峰時(shí)間分析組分的疏水特性。圖3-A和3-B分別是超濾法和鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白的RP-HPLC分析圖譜，可以看出，2種方法獲得的6種蜂蜜蛋白在RP-HPLC圖譜中顯示出明顯的組成和疏水特性差異。

A-超濾法提取蜂蜜蛋白；B-硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白圖3 不同方法提取蜂蜜蛋白質(zhì)RP-HPLC圖譜Fig.3 The RP-HPLC profiles of honey protein obtained by different extraction methods

采用超濾法提取的6種蜂蜜蛋白，其色譜峰主要集中在22～26 min，但峰形和峰高在蜂蜜品種間差異明顯，這預(yù)示著6種蜂蜜蛋白質(zhì)中主要組分在極性上比較接近，但其種類和含量差異較大(圖3-A)。另外，土蜂蜜和荊條蜜分別在洗脫時(shí)間10 min和6 min出現(xiàn)1個(gè)明顯色譜峰，這說明這2種蜂蜜蛋白中包含特有的強(qiáng)親水性組分；而對(duì)于棗花蜜，10～21 min存在非常多的小色譜峰，這預(yù)示著超濾法提取棗花蜜蛋白包含多個(gè)極性差異較大的微量組分(圖3-A)。

從硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白R(shí)P-HPLC圖譜上可以看出(圖3-B)，土蜂蜜尤其龍眼蜜在23～26 min 出現(xiàn)比較明顯的蛋白峰，并且5～20 min也存在一些小色譜峰，這從另一角度說明硫酸-鎢酸鈉沉淀法可以分離出更多種類的土蜂蜜和龍眼蜜蛋白質(zhì)，與電泳結(jié)果相吻合；而對(duì)于棗花蜜、荊條蜜、油菜蜜和洋槐蜜，與超濾法相比，鎢酸鈉沉淀法提取蛋白R(shí)P-HPLC圖譜不僅在峰形上差異較大，而且峰面積很小(圖3-B)，這說明鎢酸鈉沉淀法獲得的蜂蜜蛋白在種類和含量上均很少，不適合用于此4種蜂蜜蛋白質(zhì)的分離。

3 結(jié)論

本文研究了中國特色棗花蜜、荊條蜜、龍眼蜜、土蜂蜜、洋槐蜜和油菜蜜蛋白質(zhì)電泳行為的差異，以及不同蛋白質(zhì)提取方法對(duì)6種蜂蜜蛋白的分離效果。結(jié)果表明，6種不同花源蜂蜜表現(xiàn)出明顯的蛋白質(zhì)電泳行為差異，其蛋白條帶遍布于14.4～97.4 kDa，但蛋白質(zhì)組成和含量在蜂蜜品種間差異明顯，且僅部分品種在> 97.4 kDa存在較多高分子質(zhì)量蛋白；采用超濾法和硫酸-鎢酸鈉沉淀法提取蜂蜜蛋白質(zhì)時(shí)，超濾法適合于棗花蜜、荊條蜜、洋槐蜜和油菜蜜，而硫酸-鎢酸鈉沉淀法則適合于土蜂蜜和龍眼蜜，并且2種方法獲得的, 6種蜂蜜蛋白在SDS-PAGE和RP-HPLC圖譜中表現(xiàn)出明顯的分子質(zhì)量大小和疏水特性差異。