高婭北，婁曉平，陳二龍，張保全，張仲文，史久長(zhǎng)，陳小翔，宋朝鵬*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市農(nóng)業(yè)路63 號(hào) 450002

2. 浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，杭州市中山南路77 號(hào) 310004

煙葉腐爛和霉變是烘烤過(guò)程中所發(fā)生的烤壞煙的常見(jiàn)類(lèi)型，嚴(yán)重影響煙葉品質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失，給煙葉生產(chǎn)帶來(lái)極大的影響［1-2］。因此，探究煙葉在烘烤過(guò)程中的腐爛和霉變發(fā)生規(guī)律及機(jī)制對(duì)提高烤煙產(chǎn)量及品質(zhì)具有重要意義。掃描電鏡具有高分辨率、視野范圍廣、富有立體感等特點(diǎn)，可用于觀測(cè)煙葉的變化。王亮等［3］通過(guò)掃描電鏡研究了煙梗和煙葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)；過(guò)偉民等［4］采用掃描電鏡觀測(cè)各部位煙葉微觀結(jié)構(gòu)的差異；寧敏等［5］通過(guò)該方法研究了再造煙葉的形貌結(jié)構(gòu)；陳二龍等［6］利用掃描電鏡分析了烘烤過(guò)程中霉變煙葉的組織微觀結(jié)構(gòu)，表明隨著烘烤時(shí)間的延長(zhǎng)，主脈逐漸破損，異物逐漸增加，霉菌逐漸增多，至完全覆蓋于主脈端口，但異物的主要成分和含量尚不明確。能譜儀具有直觀呈現(xiàn)目標(biāo)元素含量及分布特征，且無(wú)損測(cè)定、分辨率高和測(cè)定速度快等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于煙葉成分的研究中，但主要集中在再造煙葉［7-10］和不同施肥量對(duì)煙葉元素含量與分配的影響方面［11］，而用于煙葉腐爛和霉變的研究較少。因此，采用掃描電鏡對(duì)腐爛和霉變煙葉主脈的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并采用能譜技術(shù)對(duì)主脈及其在腐爛和霉變過(guò)程中分泌異物的主要成分和含量進(jìn)行測(cè)定，旨在揭示烘烤過(guò)程中煙葉的腐爛和霉變機(jī)制，為防控?zé)熑~腐爛和霉變提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2017 年設(shè)置在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)。供試品種為云煙85，土壤肥力均勻，適中，土壤pH 7.67，田間輸水系統(tǒng)通暢；按優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行大田管理和采收；采收煙葉為葉面積和葉色較為一致的中部（第9～11 片）適熟煙葉。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

參照陳二龍等［12］的方法將試驗(yàn)煙葉放置于烘烤過(guò)程中易于發(fā)生腐爛和霉變的條件下烘烤（氣流上升式四層密集烤房頂層，相對(duì)濕度≥99.9%），參照三段式烘烤工藝進(jìn)行參數(shù)設(shè)定［13］。參考陳二龍等［6］的方法取烘烤前鮮煙葉和烘烤24 h 腐爛和霉變的煙葉，去除兩側(cè)葉耳，取主脈端口組織進(jìn)行樣品制備，用于掃描電鏡測(cè)試。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 掃描電鏡觀察和能譜檢測(cè)

取制備樣品，快速滴加數(shù)滴2.5%戊二醛固定液（4 ℃，由美國(guó)Alfa Aesar 公司生產(chǎn)的25%戊二醛配制而成），采用吉列雙刃刀片于載玻片上取1 mm厚度的煙葉主脈端口截面作為樣品，置于裝有2.5%戊二醛固定液的樣品瓶中。同時(shí)采用注射器抽取氣體，直至樣品下沉懸浮于固定液中。利用封口膜封口，在4 ℃條件下放置4 h，使樣品充分固定。用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PB, pH7.0）沖洗固定樣，1%的鋨酸溶液（美國(guó)Ted Pella 公司）進(jìn)一步固定樣品，經(jīng)乙醇系列脫水（國(guó)產(chǎn)無(wú)水乙醇配制成30%、50%、70%、85%、95%和100%乙醇溶液），臨界點(diǎn)干燥，噴金鍍膜，使用Quanta 200 掃描電鏡（荷蘭FEI 公司），于20 kV 條件下觀察樣品，采用X 射線(xiàn)光電子能譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）測(cè)定元素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［14-15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐爛和霉變煙葉特征分析

烤后腐爛和霉變的煙葉主要表現(xiàn)為葉基部腐爛呈褐色，且含有灰色的霉菌菌絲，但腐爛區(qū)域大于霉變區(qū)域（圖1A），與烘烤中煙葉腐爛和霉變的特點(diǎn)有關(guān)，見(jiàn)圖1B～F。煙葉在烘烤過(guò)程中，主脈端口首先產(chǎn)生褐變，隨后發(fā)生腐爛（圖1B）；煙葉主脈組織壞死為霉菌的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了條件。因此，霉變首先發(fā)生在煙葉主脈端口（圖1C），煙葉腐爛區(qū)域的四周呈現(xiàn)放射狀，方向和位置與主支脈有關(guān)（圖1D）。煙葉霉變狀態(tài)與腐爛狀態(tài)相似，由端口向主脈、支脈以及向兩側(cè)有一定的擴(kuò)展（圖1E、F）。因此，煙葉腐爛發(fā)生時(shí)間早于煙葉霉變，煙葉腐爛和霉變均以主、支脈為主，然后向兩側(cè)擴(kuò)散，且煙葉腐爛擴(kuò)散速度大于霉變擴(kuò)散速度?？梢?jiàn)，烤后煙葉腐爛區(qū)域大于霉變區(qū)域。

2.2 腐爛和霉變煙葉主脈微觀結(jié)構(gòu)分析

鮮煙葉及烘烤過(guò)程中腐爛和霉變的主脈微觀結(jié)構(gòu)通過(guò)環(huán)掃電鏡觀測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。烘烤前鮮煙葉主脈的薄壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，輪廓較為清晰，由表皮至中柱，細(xì)胞逐漸增大（圖2A）。在烘烤過(guò)程中，細(xì)胞壁被破損，且產(chǎn)生大量晶體，位于截面表層或細(xì)胞腔內(nèi)，部分晶體聚集成簇（圖2B）；煙葉主脈分泌的晶體多呈現(xiàn)四邊或五邊形，厚度為細(xì)胞壁的2 倍左右，晶體內(nèi)部具有規(guī)則的四邊形空隙結(jié)構(gòu)，且各空隙之間的間隔較為一致（圖2C）。霉菌菌絲生長(zhǎng)于晶體上（圖2D）；此外隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損和晶體量的增加，霉菌大量生長(zhǎng)繁殖，且菌絲具有分支（圖2E）。因此，煙葉腐爛發(fā)生先于煙葉霉變，且發(fā)生霉變的菌絲依附在晶體上。

2.3 腐爛和霉變煙葉能譜測(cè)定

圖1 烘烤期間煙葉腐爛和霉變特征Fig.1 Characteristics of mildew and rot of tobacco leaves during flue-curing

圖2 腐爛和霉變煙葉主要位置的微觀結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of main positions of moldy and rotten tobacco leaves

由于環(huán)掃電鏡觀察到霉變菌絲著生于煙葉主脈細(xì)胞所分泌的晶體上，因此，通過(guò)X 射線(xiàn)能譜儀分析主脈細(xì)胞和晶體的主要元素，結(jié)果見(jiàn)圖3 和表1。S1、S2 和S3 均含有Ca、Na 和O，但3 種元素含量存在較大差異，其中S1 的Na 和O 元素含量均最高，而S3 相應(yīng)的元素含量最低，但S3 的Ca 元素含量大于S1，而S2 介于兩者之間。除以上3 種元素之外，S1、S2 和S3 含有的元素種類(lèi)存在差異。S1 檢測(cè)出C，未檢測(cè)出P；S3 檢測(cè)出P，未檢測(cè)出C；S2 含有C 和P?？梢?jiàn)，晶體并非細(xì)胞壁的破損成分，而為烘烤過(guò)程中煙葉自身代謝的產(chǎn)物，且該產(chǎn)物具有一定的特異性。

圖3 不同測(cè)定點(diǎn)的能譜圖Fig.3 Energy spectrum of different measurement points

表1 不同測(cè)定點(diǎn)的主要元素含量Tab.1 Contents of main elements at different determination points （%）

3 討論

本研究結(jié)果表明，在烘烤過(guò)程中煙葉先腐爛、后霉變，這種變化規(guī)律與陳二龍等［6］的研究結(jié)果一致。原因可能是由于抗性較弱的組織易引發(fā)腐爛病原菌的入侵和擴(kuò)增，致使組織壞死，從而有助于霉菌入侵，并為霉菌的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造營(yíng)養(yǎng)條件所引起的［16-18］；本試驗(yàn)中，煙葉腐爛和霉變發(fā)生順序依次為主脈、支脈和葉片，這種變化規(guī)律可能與煙葉中的水分分布有關(guān)，因?yàn)橹参锝M織含水率越高，越易發(fā)生腐爛和霉變［19-20］，而煙葉中含水率為主脈＞支脈＞葉片［21-22］，因此煙葉腐爛和霉變呈現(xiàn)該規(guī)律；烘烤過(guò)程中煙葉腐爛和霉變大部分只發(fā)生在煙葉的葉基部，部分蔓延至葉中部，但很少能蔓延至葉尖，這可能也是由于煙葉整體含水率表現(xiàn)為葉基＞葉中＞葉尖所引起的［23］。

煙葉主脈薄壁細(xì)胞中含有的一定量的草酸鈣砂晶［24］，具有解毒、防御和平衡離子的作用［25-26］。有研究表明，在一定條件下誘導(dǎo)特定時(shí)間即可在植物體內(nèi)合成草酸鈣砂晶，其形狀一般為針形、菱形片狀或是片形簇狀，元素組成為Ca、C 和O，多沉積在莖、葉主脈或葉肉細(xì)胞中［27-32］。本試驗(yàn)條件下，烘烤過(guò)程中腐爛煙葉的主脈細(xì)胞中分泌出大量晶體，呈現(xiàn)清晰的菱形片狀，通過(guò)與前人對(duì)煙草中草酸鈣砂晶的研究結(jié)果比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其形狀大小具有較高的相似度［33］；通過(guò)能譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該晶體也含有大量Ca 和O 元素，其元素組成也與其他作物中的草酸鈣砂晶較為一致，且產(chǎn)生于主脈薄壁細(xì)胞中，與多數(shù)植物草酸鈣砂晶的沉積部位相同；因此推測(cè)該晶體為草酸鈣砂晶。由于該晶體出現(xiàn)于腐爛煙葉的主脈細(xì)胞中，且具有解毒、防御等作用，因此推測(cè)在本研究中煙葉主脈細(xì)胞分泌晶體這一行為是主脈在腐爛時(shí)自身機(jī)體為抵御病菌侵染、修復(fù)破損屏障的自體應(yīng)激反應(yīng)。在烘烤過(guò)程中霉變煙葉的霉菌菌絲著生于晶體上，可能是由于草酸鈣砂晶中含有大量的Ca 元素，而Ca 能夠促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)所引起的［34］。此外，該晶體含有一定量的P 元素，而P 具有抑制菌絲生長(zhǎng)的作用［35］，與晶體促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的結(jié)果相反，可能是由于P元素含量相對(duì)較低或不同種類(lèi)霉菌抑制作用存在差異所致；除此之外，P 元素能以磷酸根的形式調(diào)控草酸鈣砂晶形貌和尺寸，從而避免晶體過(guò)大或濃度過(guò)高造成對(duì)植物的傷害［36］，因此煙葉主脈分泌的晶體中所含有的P 元素可在一定程度上調(diào)控晶體的尺寸和濃度，從而避免晶體的尺寸和濃度對(duì)煙葉造成不利影響。但目前有關(guān)腐爛煙葉主脈細(xì)胞草酸鈣砂晶的產(chǎn)生機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在烘烤過(guò)程中，煙葉腐爛發(fā)生時(shí)間、擴(kuò)散速度均先于霉變，且二者發(fā)生部位一致，均首先發(fā)生于主脈，而后向兩側(cè)葉肉延伸；煙葉腐爛時(shí)，主脈產(chǎn)生菱形片狀晶體，晶體中含有30.34%的Ca、44.40%的O、24.92%的P，以及0.34%的Na 元素，推測(cè)該晶體可能為草酸鈣砂晶，通過(guò)掃描電鏡觀察到煙葉霉變產(chǎn)生的霉菌菌絲著生于該晶體上。可見(jiàn)，煙葉霉變和腐爛主要發(fā)生在葉基部葉脈，煙葉腐爛產(chǎn)生的含Ca 草酸鈣砂晶促進(jìn)了煙葉霉變。