關(guān)素華 曾慶輝 張曉飛

摘要：為研究德式乳酸桿菌對(duì)黃河鯉應(yīng)激前后抗應(yīng)激指標(biāo)、血液免疫指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)和HSP70、HSP90基因表達(dá)的影響，選取黃河鯉450尾，隨機(jī)分為5組（每組3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾魚(yú)），分別投喂在基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度乳酸菌（0、1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/g）的日糧，養(yǎng)殖8周后，進(jìn)行擁擠脅迫。試驗(yàn)結(jié)果表明：應(yīng)激前，皮質(zhì)醇濃度在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌組顯著低于對(duì)照組（P<0.05），血糖和乳酸濃度在試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組（P<0.05），溶菌酶活性在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），C3和C4在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。應(yīng)激后，血液皮質(zhì)醇、血糖和乳酸濃度都有不同程度的升高，這些指標(biāo)在添加乳酸菌組的含量均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），血液溶菌酶活性、C3和C4濃度也有升高趨勢(shì)，且在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對(duì)照組（P<0.05）;應(yīng)激前后SOD和CAT活性在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），MDA含量呈相反的趨勢(shì)，在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌組顯著低于對(duì)照組（P<0.05），應(yīng)激使HSP70和HSP90基因表達(dá)均有升高趨勢(shì)，在應(yīng)激前后試驗(yàn)組的HSP70和HSP90基因表達(dá)量大部分都顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。該研究結(jié)果顯示，飼料中添加1×106～1×107 CFU/g 德式乳酸菌能提高黃河鯉的免疫力、抗氧化和抗應(yīng)激的能力。

關(guān)鍵詞：德式乳酸桿菌;黃河鯉;免疫;應(yīng)激;抗氧化

中圖分類(lèi)號(hào)： S942.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0166-05

應(yīng)激是一些有害因子引起動(dòng)物發(fā)生一系列生理防御的總和。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，應(yīng)激普遍存在，如溶氧量過(guò)低、水溫變化、驚嚇、高密度飼養(yǎng)、酸堿度變化、分池、捕撈等都可能造成應(yīng)激。當(dāng)魚(yú)類(lèi)受到這些應(yīng)激后會(huì)出現(xiàn)一系列的生理變化，如體內(nèi)皮質(zhì)激素的升高，并引起溶菌酶、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞活力的下降，抑制動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，使其增質(zhì)量減緩，成活率下降，嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[1]。因此如何防止和減輕應(yīng)激發(fā)生是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

在過(guò)去，一旦疾病暴發(fā)，多使用抗生素來(lái)解決此類(lèi)問(wèn)題，但是使用抗生素帶來(lái)了很多負(fù)面影響，比如病菌抗藥性的增強(qiáng)、抗生素殘留等問(wèn)題。近年來(lái)，使用益生元和益生素來(lái)提高水產(chǎn)動(dòng)物健康水平的報(bào)道也日益增多[2-5]，已有報(bào)道指出，果寡糖、芽孢桿菌、維生素、大黃素等在水產(chǎn)動(dòng)物上均有抗應(yīng)激的效果[6-11]，但是關(guān)于乳酸菌抗應(yīng)激的功效報(bào)道較少，因此，本研究通過(guò)在飼料中添加不同濃度的乳酸菌，飼喂黃河鯉，研究乳酸菌對(duì)黃河鯉免疫、抗氧化和抗應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在探討乳酸菌在黃河鯉上的作用效果，為防止魚(yú)類(lèi)疾病暴發(fā)和應(yīng)激發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 黃河鯉魚(yú)，購(gòu)自河南省洛陽(yáng)市某養(yǎng)殖場(chǎng)，初始質(zhì)量為（15±0.3） g，試驗(yàn)選擇規(guī)格一致、健康的鯉魚(yú)450尾，隨機(jī)分為5組，其中第1組為對(duì)照組，對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，其他4組為試驗(yàn)組，投喂試驗(yàn)飼料，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾魚(yú)，共15缸。

1.1.2 試驗(yàn)飼料 基礎(chǔ)飼料主要用魚(yú)粉、豆粕、棉粕、菜粕作為蛋白源，以魚(yú)油和豆油作為脂肪源，以次粉作為糖原，配制成蛋白含量為33.6%、脂肪含量為6.62%的基礎(chǔ)飼料（表1），試驗(yàn)飼料是在基礎(chǔ)飼料中分別添加1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/g 德式乳酸桿菌，各種飼料原料充分粉碎后均過(guò)60目篩，先把磷酸二氫鈣、食鹽、預(yù)混料、膨潤(rùn)土等混勻，再加入大料并逐級(jí)混合，然后在乳酸菌中加入適量的水，與飼料原料混合后用絞肉機(jī)制成1.2 mm的顆粒飼料，并在40 ℃下烘 15 h，至飼料水分含量在10%左右，保存在-4 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 養(yǎng)殖試驗(yàn)于2015年7—9月在河南科技大學(xué)水族科學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，將黃河鯉馴化2周，馴養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)開(kāi)始后，每天投喂3次，分別在08：00、12：00、17：00各投喂1次，日投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的3%～5%，并根據(jù)攝食情況進(jìn)行適度的調(diào)整，確保飼料在0.5 h內(nèi)吃完，養(yǎng)殖期間每天測(cè)水溫、溶氧量，每2 d換水1次，每次換水1/3以保證水質(zhì)，整個(gè)試驗(yàn)期間水質(zhì)記錄如下：水溫為（26±1） ℃，溶解氧含量>5 mg/L，氨氮含量<0.01 mg/L，pH值為6.8～7.5，養(yǎng)殖周期持續(xù)8周。

1.2.2 抗應(yīng)激試驗(yàn) 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停飼24 h，選取規(guī)格基本一致的10尾魚(yú)，參照Xie等的方法[12]進(jìn)行應(yīng)激試驗(yàn)，采取高密度（100 g/L）進(jìn)行擁擠脅迫試驗(yàn)，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)平行，放置于小型玻璃缸中，水溫、溶氧量同“1.2.1”節(jié)，應(yīng)激期間保持安靜，防止額外應(yīng)激，持續(xù)應(yīng)激6 h后進(jìn)行采樣。

1.2.3 血液采集與測(cè)定

1.2.3.1 血液指標(biāo)的測(cè)定 分別在應(yīng)激前和應(yīng)激后對(duì)魚(yú)進(jìn)行麻醉，尾靜脈取血，4 ℃、1 500 r/min離心10 min，取血清，于-20 ℃保存，用作應(yīng)激和血液免疫指標(biāo)的分析。皮質(zhì)醇濃度采用放免法進(jìn)行測(cè)定，血糖濃度的測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法，乳酸濃度的測(cè)定采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法，溶菌酶活性采用比濁法進(jìn)行測(cè)定，補(bǔ)體C3和C4采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定，以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，具體操作見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.3.2 肝臟抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 應(yīng)激前后快速分離肝臟，于液氮中速凍并保存，稱取一定量的肝臟樣品，用生理鹽水按1 g ∶ 9 mL（肝臟 ∶ 生理鹽水）的比例冰浴勻漿，然后于 4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清液用于酶活分析，超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定參照黃嘌呤氧化酶法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用紫外法，丙二醛（MDA）含量的測(cè)定參照氧化脂質(zhì)硫代巴比妥酸分光光度計(jì)法。

1.2.3.3 基因表達(dá) RNA提?。喝「闻K組織0.1 g左右，參照Trizol使用說(shuō)明書(shū)，提取RNA然后測(cè)定其濃度和質(zhì)量，一般D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之間，最后稀釋成相同的濃度進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。

cDNA反轉(zhuǎn)錄：參照寶生物工程（大連）有限公司提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序：第1步42 ℃反應(yīng) 40 min，第2步90 ℃反應(yīng)2 min，最后于4 ℃保存。之后10倍稀釋?zhuān)詡銻T-PCR使用。

RT-PCR過(guò)程：用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海英捷維基生物有限公司合成（表2），按照SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa公司）使用說(shuō)明進(jìn)行RT反應(yīng)，熒光定量PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55.9 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，45個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。選用β-actin作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT方法計(jì)算HSP70和HSP90基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2007作簡(jiǎn)單處理，然后用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)各組間差異顯著時(shí)（P<0.05），用Duncans檢驗(yàn)法進(jìn)行均值間的多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 德式乳酸菌對(duì)鯉魚(yú)脅迫應(yīng)激前后血清皮質(zhì)醇、血糖和乳酸濃度的影響

由圖1、圖2、圖3可知，應(yīng)激前血液皮質(zhì)醇、血糖和乳酸濃度都比較低，皮質(zhì)醇含量在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌處理下顯著低于對(duì)照組（P<0.05），其他各組之間差異并不顯著（P>0.05）。血糖和乳酸濃度在試驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。應(yīng)激后，血液皮質(zhì)醇、血糖和乳酸濃度都有不同程度的升高，這些指標(biāo)在添加乳酸菌組中的濃度多數(shù)均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 德式乳酸桿菌對(duì)黃河鯉應(yīng)激前后血液免疫指標(biāo)的影響

由表3可知，應(yīng)激前血液溶菌酶活性在1×106和1×107 CFU/g 乳酸菌組均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），1×

108 CFU/g 乳酸菌組和對(duì)照組差異并不顯著（P>0.05）;C3和C4含量在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），其他各組之間差異不顯著;應(yīng)激后，血液溶菌酶活性、C3和C4濃度都有不同程度的升高，且1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），C4含量在1×107 CFU/g乳酸菌組也顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

2.3 德式乳酸桿菌對(duì)黃河鯉應(yīng)激前后抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，應(yīng)激前后SOD和CAT活性在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），1×105、1×108 CFU/g 乳酸菌組和對(duì)照組差異并不顯著（P>0.05）。MDA含量呈相反趨勢(shì)，應(yīng)激前后1×106、1×107 CFU/g乳酸菌組均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

2.4 德式乳酸桿菌對(duì)黃河鯉應(yīng)激前后HSP70和HSP90基因表達(dá)的影響

由圖4、圖5可知，應(yīng)激使HSP70和HSP90基因量表達(dá)均有升高趨勢(shì)，在應(yīng)激前后試驗(yàn)組的HSP70和HSP90基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

3 討論

3.1 德式乳酸菌對(duì)黃河鯉應(yīng)激指標(biāo)的影響

皮質(zhì)醇是魚(yú)體受到應(yīng)激后通過(guò)下丘腦垂體-腎間組織軸（hypothalamus-pituitary-interrenal axis，簡(jiǎn)稱HPI）所分泌的一種重要的應(yīng)激激素[13]。血液皮質(zhì)醇升高通常作為魚(yú)類(lèi)發(fā)生應(yīng)激的靈敏信號(hào)，本研究得出，在應(yīng)激后皮質(zhì)醇、血糖和乳酸含量都呈現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)，血糖的升高可能是由于隨著皮質(zhì)醇水平的升高，糖異生的關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶的活性被激活，糖異生和糖原分解作用加強(qiáng)，另外，肌糖原的分解是血液乳酸含量增加的原因之一[14]。相似的研究結(jié)果在團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala Yih）[15-16]和金頭鯛（Sparus aurata）[17]中都有報(bào)道。在飼料中添加適量濃度的乳酸菌，應(yīng)激前后皮質(zhì)醇、血糖和乳酸含量都有降低趨勢(shì)，這表明乳酸菌可以有效地緩解黃河鯉的擁擠脅迫應(yīng)激，但是具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.2 德式乳酸菌對(duì)黃河鯉血液免疫指標(biāo)的影響

溶菌酶是機(jī)體內(nèi)重要的免疫因子之一，主要由巨噬細(xì)胞核和嗜中性粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生，本研究得出，在急性應(yīng)激后，血液溶菌酶、補(bǔ)體C3和C4都有升高趨勢(shì)，這可能是由于在急性應(yīng)激條件下，魚(yú)體通過(guò)增加特定溶菌酶和補(bǔ)體含量來(lái)增加其免疫活力，共同抵抗由應(yīng)激帶來(lái)的不適反應(yīng)。有研究報(bào)道，一般急性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致溶菌酶活性的升高[18-19]，而長(zhǎng)時(shí)間的慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致其活性的顯著降低，免疫力下降[20]，發(fā)生應(yīng)激后中華鱉（Pelodiscus sinensis）補(bǔ)體C3、C4含量下降[21]，但是添加維生素C能夠促進(jìn)補(bǔ)體C3和C4的合成，相似的結(jié)果在團(tuán)頭魴[16]中也有報(bào)道。應(yīng)激抑制還可促進(jìn)補(bǔ)體C3和C4的合成，這與應(yīng)激強(qiáng)度、應(yīng)激時(shí)間以及應(yīng)激類(lèi)型都有很大的關(guān)系，但是適量的乳酸菌加強(qiáng)了溶菌酶的活性，也在一定程度上提高了補(bǔ)體C3和C4的水平，這有助于增強(qiáng)魚(yú)體的非特異性免疫力。乳酸菌的免疫增強(qiáng)作用在畜禽的研究[22-24]中也有報(bào)道，據(jù)報(bào)道，乳酸菌胞外多糖具有免疫增強(qiáng)的作用[24]。

3.3 德式乳酸桿菌對(duì)黃河鯉抗氧化指標(biāo)的影響

應(yīng)激能夠引起自由基的大量產(chǎn)生，比如 O-2 · ?和·OH，這些物質(zhì)會(huì)造成機(jī)體細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化，正常情況下機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)能夠清除這些自由基，抑制機(jī)體過(guò)氧化，使機(jī)體處于平衡狀態(tài)[25]，但是這種平衡狀態(tài)會(huì)隨著環(huán)境條件的改變而被破壞，造成氧化損傷。SOD和CAT作為主要的抗氧化酶，SOD負(fù)責(zé)把 O-2 · ?轉(zhuǎn)化成O2和H2O2，CAT能夠把H2O2分解成O2和H2O，以清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的自由基[26-27]。本研究得出，SOD和CAT的活性在應(yīng)激條件下不斷增加，防止機(jī)體的氧化損傷。抗氧化物酶活性的升高和機(jī)體的氧化應(yīng)激程度有關(guān)，氧化應(yīng)激程度越高，酶活性也會(huì)隨之升高[28]。之前的報(bào)道得出，SOD活性在應(yīng)激條件下（比如鹽度和溫度）都有升高[29]。MDA含量在應(yīng)激后呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)，這表明高密度應(yīng)激會(huì)引起黃河鯉脂質(zhì)過(guò)氧化程度的增加，這是因?yàn)閼?yīng)激會(huì)造成機(jī)體的耗氧量增加，容易造成自由基的產(chǎn)生，自由基與多不飽和脂肪酸等抗氧化脂類(lèi)反應(yīng)時(shí)，會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，并最終降解產(chǎn)生MDA。施兆鴻等研究表明，云紋石斑魚(yú)（Epinephelus moara）在氨氮脅迫條件下的MDA含量也顯著升高[10]，鹽度脅迫使云紋石斑魚(yú)的MDA含量顯著升高，但是添加適量的維生素E可有效減少脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的產(chǎn)生[11]。類(lèi)似的研究結(jié)果在其他魚(yú)類(lèi)和水產(chǎn)類(lèi)動(dòng)物中[30-33]都有報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果得出，在擁擠脅迫前后投喂1×106 CFU/g乳酸菌的SOD和CAT活性最高，MDA含量最低。本試驗(yàn)說(shuō)明，乳酸菌能夠抑制黃河鯉由應(yīng)激引起的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。乳酸菌的抗氧化功能可能與它的益菌保護(hù)作用有關(guān)，以前的試驗(yàn)證明，乳酸菌的代謝產(chǎn)物具有抗氧化功能[34-36]，乳酸菌也可能作為調(diào)節(jié)腸道微生物平衡的物質(zhì)促進(jìn)機(jī)體的抗氧化功能。

3.4 德式乳酸桿菌對(duì)黃河鯉HSP70和HSP90基因表達(dá)的影響

在HSP家族中，HSP70和HSP90參與新生蛋白質(zhì)合成和損傷蛋白的修復(fù)，并參與機(jī)體在應(yīng)激條件下的免疫應(yīng)答[37]，機(jī)體受到外界應(yīng)激（比如高溫、缺氧和細(xì)菌感染等）時(shí)，組織中HSP70和HSP90的表達(dá)量升高，從而形成保護(hù)機(jī)制，抵御應(yīng)激對(duì)機(jī)體帶來(lái)的危害[38-39]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后HSP70和HSP90的相對(duì)表達(dá)量都呈升高趨勢(shì)，其表達(dá)量升高可能因?yàn)楫?dāng)魚(yú)類(lèi)處在應(yīng)激條件下時(shí)，機(jī)體為了防止自身的氧化損傷而作出的相應(yīng)策略。類(lèi)似的研究在團(tuán)頭魴的研究中[8]也有報(bào)道，Zhang等報(bào)道，在高溫和氨氮應(yīng)激條件下HSPs的表達(dá)量均呈升高趨勢(shì)[6-7];劉波等研究表明，高溫應(yīng)激后比應(yīng)激前羅氏沼蝦HSP70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高[9]，相似的研究結(jié)果在吉富羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）[40]中也有報(bào)道。本研究得出，在飼料中添加一定濃度的乳酸菌應(yīng)激前后HSP70和HSP90的表達(dá)均有升高趨勢(shì)，從而增強(qiáng)了對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，HSPs在應(yīng)激條件下的表達(dá)與細(xì)胞的分裂、增殖和發(fā)育等生理過(guò)程都有關(guān)系，需要進(jìn)一步研究。本研究也得出，添加適量的乳酸菌能夠增強(qiáng)HSPs的表達(dá)量和機(jī)體的抗應(yīng)激能力，這和免疫指標(biāo)以及抗氧化功能得出的結(jié)果相一致，表明乳酸菌在抗應(yīng)激和增強(qiáng)免疫方面都起到重要作用。

4 結(jié)論

飼料中添加適宜水平的德式乳酸桿菌能夠提高黃河鯉的抗應(yīng)激能力、免疫力和抗氧化功能，且在本試驗(yàn)條件下，乳酸菌的最適添加量為1×106～1×107 CFU/g。

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