梁浩花，陶 紅，王亞娟，李嬌玲

(1.寧夏大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，寧夏 銀川750021； 2.寧夏(中阿)旱區(qū)資源評(píng)價(jià)與環(huán)境調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021； 3.寧夏大學(xué) 經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)又稱酞酸酯，是一類人工合成的有機(jī)化合物，作為增塑劑、添加劑在塑料、化肥、農(nóng)藥、玩具、化妝品與涂料等行業(yè)中均有廣泛使用[1]。農(nóng)膜的大量使用被認(rèn)為是土壤中PAEs重要來源之一，由于PAEs與塑料聚合物高分子碳鏈以氫鍵或范德華力結(jié)合，并未真正與塑料化學(xué)鍵結(jié)合，使得PAEs分子在加工、使用、處置的過程中容易遷移到土壤環(huán)境中[2]。土壤中PAEs不僅影響土壤質(zhì)量、植物的生長(zhǎng)和品質(zhì)，而且在作物中具有一定的生物累積效應(yīng)，通過食物鏈富集，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。其中，鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]是土壤中檢出率和含量較高的2種PAEs化合物，具有典型的內(nèi)分泌干擾性和潛在的“三致”效應(yīng)，被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(Environmental Protection Agency，EPA)列入“優(yōu)先控制污染物”。一些研究報(bào)道了我國(guó)不同地區(qū)土壤中DBP和DEHP的含量，如北京設(shè)施蔬菜基地[4](0.440、0.380 mg·kg-1)，咸陽(yáng)市郊菜地[5](0.037～6.313、ND～3.871 mg·kg-1)，汕頭蔬菜產(chǎn)區(qū)[6](ND～7.652、0.001～4.197 mg·kg-1)，以上地區(qū)土壤中DBP和DEHP都為主要的PAEs類污染物。

DBP和DEHP在自然環(huán)境中的水解、光解速率緩慢，屬于難降解物質(zhì)。微生物降解是其主要降解途徑之一[7]。近年來，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者針對(duì)PAEs類污染物的微生物降解進(jìn)行了較多研究，例如針對(duì)DBP的Geotrichumsp.[7]、Brucellasp.和Sinobactersp.[8]、變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[9]、Paenibacillussp.[10]、Bacillussubtilis[11]、Gordoniasp.[12]；針對(duì)BBP的瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)[13]；針對(duì)DEHP的嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinivorans)[14]、匯合分支桿菌(Mycobacteriumconfluentis)[15]、Pseudomonassp.[16]、戈登氏菌[17](Gordoniasp.)；針對(duì)DMP的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[18]、戴爾福特菌屬(Delftiasp.)[19]。目前，大多數(shù)研究針對(duì)的是單一短側(cè)鏈或者單一復(fù)雜的、不容易降解的長(zhǎng)側(cè)鏈PAEs的生物降解，關(guān)于同一菌株同時(shí)降解DBP和DEHP的研究較少。研究同一菌株對(duì)多種PAEs的降解特性，修復(fù)多種PAEs污染的農(nóng)田土壤，以減少有機(jī)污染物對(duì)環(huán)境的危害和提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和安全具有重要應(yīng)用價(jià)值。節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)是一類革蘭氏陽(yáng)性菌，能降解多種有機(jī)污染物，對(duì)于有機(jī)污染土壤的修復(fù)具有重大意義。已有節(jié)桿菌降解PAEs的報(bào)道較少，褚嬌艷等[20]研究表明，Arthrobactersp. ZJUTW對(duì)DBP有較強(qiáng)的降解能力和較高的耐受性；周長(zhǎng)健[21]研究表明，Arthrobactersp. JQ-1能修復(fù)DEHP污染的土壤，但是關(guān)于節(jié)桿菌同時(shí)降解DBP和DEHP研究尚未見報(bào)道。

本課題組前期對(duì)于銀川市東郊設(shè)施菜地土壤中PAEs的污染現(xiàn)狀研究表明，該區(qū)域PAEs類主要污染物為DBP和DEHP。因此，本研究以銀川市東郊設(shè)施菜地土壤為材料，從中篩選出能同時(shí)降解DBP和DEHP的菌株，并通過生理生化特征、16S rDNA序列分析技術(shù)鑒定菌株，分析不同環(huán)境因素對(duì)菌株的生長(zhǎng)及降解特性影響，以期為該區(qū)域PAEs污染土壤的治理和生物修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)供試土壤樣品采自銀川市東郊設(shè)施蔬菜基地，將采集的鮮樣封存于4 ℃的冰箱中備用。

1.2 培養(yǎng)基配制

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)：K2HPO4·3H2O 1.0 g，NaCl 1 g，NH4NO30.5 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.01 g，定容至1 L，調(diào)整pH為7，于121 ℃下濕熱滅菌30 min。固體培養(yǎng)基加瓊脂18.0 g·L-1。

選擇培養(yǎng)基:移取0.2 mL的2 g·L-1的DBP和DEHP混合溶液于100 mL滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，待丙酮完全揮發(fā)，即可得到濃度為100 mg·L-1的DBP和DEHP混合無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基加瓊脂18.0 g·L-1。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，定容至1 L，調(diào)整pH為7，于121 ℃濕熱滅菌30 min，固體培養(yǎng)基加瓊脂18.0 g·L-1。

1.3 DBP和DEHP降解菌的篩選、純化與鑒定

稱取10 g土樣，加入盛有90 mL蒸餾水和10 mL玻璃珠的三角瓶，30 ℃，175 r·min-1，振蕩30 min，靜置。取1 mL的上清液接種于含有100 mg·L-1的DBP和DEHP混合的100 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，避光條件下振蕩培養(yǎng)7 d。采用梯度壓力馴化法，按1%的接菌量逐步轉(zhuǎn)接至300、600、800、1 000 mg·L-1的DBP和DEHP混合無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，每7 d作為1個(gè)馴化周期轉(zhuǎn)接1次，持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

取100 μL終期馴化液，涂布于DBP和DEHP混合的100 mg·L-1牛肉膏蛋白胨固體平板上，然后置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待長(zhǎng)出肉眼可見菌落后，觀察其生長(zhǎng)特征，篩選出長(zhǎng)勢(shì)最好的菌株，挑取單菌落將其反復(fù)劃線接種于新的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，直至鏡檢純化為止。將菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序工作。

1.4 菌株對(duì)DBP和DEHP降解能力測(cè)定

菌懸液的制備：挑取光滑完整的菌落，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器中，30 ℃、175 r·min-1培養(yǎng)48 h。取出牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)液分裝于100 mL滅菌的離心管中，室溫條件下4 000 r·min-1離心10 min，收集濕菌體。然后用滅菌的0.9% NaCl溶液洗滌3次，再用0.9% NaCl溶液將菌體調(diào)配成菌懸液，使其在波長(zhǎng)為600 nm下的吸光度為1.0。

將分離純化后的不同菌株，以2%接菌量分別接種到100 mg·L-1的DBP和DEHP混合的100 ml滅菌無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，35 ℃，175 r·min-1培養(yǎng)3 d，以不接菌的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，測(cè)定DBP和DEHP的降解率和吸光度，確定最佳降解菌株。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.5 環(huán)境條件對(duì)降解菌生長(zhǎng)和PAEs降解性能的影響

1.5.1 轉(zhuǎn)速對(duì)AS001生長(zhǎng)與降解鄰苯二甲酸酯的影響

配制初始濃度為100 mg·L-1的DBP/DEHP無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH=7，滅菌。分別將2%菌懸液加入50 mL的DBP/DEHP無機(jī)鹽溶液中，在35 ℃條件下分別以0、100、150、175、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，以不接菌液的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定DBP、DEHP含量和D600。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.2 pH對(duì)AS001生長(zhǎng)和降解鄰苯二甲酸酯的影響

配制初始濃度為100 mg·L-1的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，用0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH 調(diào)整pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，滅菌。將2%菌懸液加入50mL的DBP/DEHP無機(jī)鹽溶液中，分別在35 ℃、175 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)3 d，以不接菌液的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定DBP、DEHP含量和D600。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.3 初始濃度對(duì)AS001生長(zhǎng)與降解鄰苯二甲酸酯的影響

分別配制總濃度為50、100、200、300、400 mg·L-1的DBP/DEHP無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH=7，滅菌。將2%菌懸液加入50 mL的DBP/DEHP無機(jī)鹽溶液中，在35 ℃、175 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)3 d，以不接菌液的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定DBP和DEHP含量、D600。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.4 接菌量對(duì)AS001生長(zhǎng)與降解鄰苯二甲酸酯的影響

配制初始濃度為100 mg·L-1的DBP/DEHP無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH=7，滅菌。分別將1%、2%、3%、4%、5%菌懸液加入50 mL的DBP/DEHP無機(jī)鹽溶液中，分別在35 ℃、175 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)3 d，以不接菌液的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定DBP和DEHP含量、D600。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.5 溫度對(duì)AS001生長(zhǎng)與降解鄰苯二甲酸酯的影響

配制初始濃度為100 mg·L-1的DBP/DEHP無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH=7，滅菌。將4%菌懸液加入50 mL的DBP/DEHP無機(jī)鹽溶液中，分別在15、25、35、45 ℃，175 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)3 d，以不接菌液的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定DBP和DEHP含量、D600。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 分析方法

1.6.1 液體中DBP和DEHP的提取方法

參照饒瀟瀟等[22]和王冬瑩[23]的方法，向100 mL的DBP和DEHP無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入1 mL的100 μg·mL-1苯甲酸芐酯，加入萃取液乙酸乙酯30 mL，放入恒溫振蕩器中振蕩30 min。轉(zhuǎn)移至分液漏斗中振蕩5 min，分液，再用30 mL乙酸乙酯沖洗3次，將乙酸乙酯溶液全部轉(zhuǎn)移到平底燒瓶中。取出凈化柱，依次加入2 g無水硫酸鈉，4 g弗羅里硅土，2 g無水硫酸鈉。先用10 mL乙酸乙酯預(yù)洗柱子，棄去該淋洗液，再用50 mL乙酸乙酯洗脫。收集全部洗脫液至雞心瓶中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至蒸干。加入甲醇定容，過有機(jī)系0.22 μm濾膜后進(jìn)行氣相色譜分析。

1.6.2 生物量的測(cè)定

菌株生物量的測(cè)定：采用UV-9600紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量培養(yǎng)液在600 nm時(shí)的吸光度D600。

1.6.3 PAEs的測(cè)定

氣相色譜條件。色譜柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣N2(純度≥99.999%)，進(jìn)樣口溫度260 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度290 ℃，分流進(jìn)樣，分離比為30，進(jìn)樣量為1 μL。程序升溫：60 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1的速度升至220 ℃，保持1 min；以3 ℃·min-1的速度升至290 ℃，保持5 min。

1.6.4 菌株生理生化特征的測(cè)定方法

生理生化特征試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[24]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和分析采用軟件Excel，繪圖利用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選、形態(tài)和生理生化特征

采用富集馴化法從銀川市東郊設(shè)施菜地土壤中分離得到了3株菌株，分別命名為AS001、AS002和AS003。不同菌株對(duì)DBP和DEHP降解能力的比較結(jié)果(圖1)表明，菌株2即菌株AS001的降解效果最佳。菌株AS001在固體平板上培養(yǎng)，形成的菌落較大，呈淡黃色、濕潤(rùn)、微凸、黏質(zhì)不透明(圖2)。無絲狀體，形態(tài)呈桿狀，長(zhǎng)度約1.2～8.0 μm。菌株AS001革蘭氏染色呈陽(yáng)性(圖2)，接觸酶、硫化氫、吲哚和V-P試驗(yàn)呈現(xiàn)陽(yáng)性，甲基紅、脲酶、檸檬酸鹽、硝酸鹽還原、酪素水解、淀粉水解試驗(yàn)呈現(xiàn)陰性。

2.2 菌株的16S rDNA分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹

由生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)降解菌AS001進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，AS001的16S rDNA基因序列大小為1 485 bp，GenBank中序列登錄號(hào)為MG569788。在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與菌株AS001的16S rDNA序列相似性最高的是節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)，其同源性達(dá)到99%。從GenBank中取同源性高的相關(guān)序列作為參考菌株序列，首先用Clustal X將序列進(jìn)行完全比對(duì)，然后用MEGA 5軟件中Neighbor-joining對(duì)其做系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)。如圖3所示，菌株AS001與菌株

圖2 菌株AS001形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Colonial morphology and gram staining result of strain AS001

采用鄰接法計(jì)算距離，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值是自展值(%)，括號(hào)中為菌株的登錄號(hào)。Distances were calculated using neighbor-joining method. The numbers at the branch nodes were bootstrap values (%). Accession numbers of the bacterial isolates were shown in brackets.圖3 菌株AS001和相關(guān)菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain AS001 and other related strains

SD41的親緣關(guān)系最近；菌株1132G-1與S15、菌株TD3與A-1、菌株m3與X4的自展值為100；菌株scl-2與前6株菌株的自展值為100，它們之間親緣關(guān)系非常相近；菌株ZXY-2與前7株菌株的自展值為99，它們之間的親緣關(guān)系也很近。

2.3 環(huán)境條件對(duì)降解菌的生長(zhǎng)和降解性能的影響

2.3.1 轉(zhuǎn)速對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響

轉(zhuǎn)速?zèng)Q定了氧氣的供應(yīng)程度和碳源的分布是否均勻[21]。如圖4所示：總體上，菌株對(duì)DBP的降解率高于對(duì)DEHP的降解率；隨著搖床轉(zhuǎn)速增大，降解菌AS001的D600逐漸升高，搖床轉(zhuǎn)速在150～175 r·min-1時(shí)，菌株AS001生長(zhǎng)情況較好，且菌株對(duì)DBP和DEHP的降解率隨著轉(zhuǎn)速的增大顯著增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速為175 r·min-1時(shí)，菌株對(duì)DBP和DEHP降解率達(dá)到最高，分別為85.55%和39.86%，菌株的D600值最大(0.137)，但轉(zhuǎn)速增加至200 r·min-1時(shí)，菌株生長(zhǎng)和對(duì)DBP和DEHP的降解率迅速下降。主要是隨著轉(zhuǎn)速的增大，培養(yǎng)液中溶解氧的含量不斷增加，利于菌株的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)而使其生物量不斷增加[25]；但是當(dāng)轉(zhuǎn)速太高時(shí)，剪切力較大，菌絲容易被打斷，不利于菌絲體生長(zhǎng)[26]。

2.3.2 pH對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響

圖5 pH對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響Fig.5 Effect of pH on biodegradation of DBP and DEHP by AS001 and its growth

酸堿度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的又一重要因素，pH能夠影響菌株的酶活性、細(xì)胞膜的通透性和酶促反應(yīng)速率，從而對(duì)菌株在轉(zhuǎn)化有機(jī)污染物過程中的生理和生化性質(zhì)產(chǎn)生影響[21]。由圖5可知，總體上，菌株AS001對(duì)DBP的降解率高于對(duì)DEHP的降解率。菌株生長(zhǎng)及對(duì)DBP和DEHP降解率隨著pH的升高先增加后降低，在pH=7時(shí)DBP和DEHP的降解率達(dá)到最大，分別為80.87%和43.13%，且D600也最大，表明中性環(huán)境中菌株生長(zhǎng)最好，降解效果最佳；pH超過7后，菌株生長(zhǎng)及對(duì)DBP和DEHP的降解率均呈緩慢下降趨勢(shì)，pH=8時(shí)，菌株的D600及對(duì)DBP和DEHP的降解率仍呈現(xiàn)較高值；pH>8時(shí)，菌株的D600及對(duì)DBP和DEHP的降解率呈明顯下降趨勢(shì)。說明該菌株可在pH為7～8條件下生長(zhǎng)良好，在pH為5～6或者pH>8時(shí)，酶活性和酶促反應(yīng)速率都會(huì)受到抑制，從而降低菌株對(duì)PAEs的降解。

2.3.3 初始濃度對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響

初始濃度對(duì)菌株AS001生長(zhǎng)及DBP和DEHP降解率的影響如圖6所示，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 mg·L-1，菌株對(duì)DBP和DEHP降解率分別為60.89%和30.95%；底物濃度為100 mg·L-1時(shí)，菌株的D600及對(duì)DBP和DEHP的降解率最大，D600為0.13，降解率分別為73.63%和42.58%；隨著底物濃度的繼續(xù)升高，菌株生長(zhǎng)的D600及對(duì)PAEs的降解率顯著下降。表明低濃度的PAEs可為降解菌株提供充足的碳源和能源以滿足其生長(zhǎng)代謝需求，但是高濃度PAEs環(huán)境會(huì)對(duì)降解菌產(chǎn)生一定的毒害作用，降低菌株對(duì)PAEs的降解能力[27]。在不同濃度條件下，DBP的降解率均大于DEHP，這可能與分子的大小和結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度有關(guān)[23]。一般而言，PAEs側(cè)鏈越短，微生物降解效率越高，DEHP屬于長(zhǎng)鏈PAEs化合物，相對(duì)分子質(zhì)量較大，但水溶性較低，辛醇-水分配系數(shù)較大，不容易被微生物降解；而DBP相對(duì)DEHP更容易被微生物降解[28-29]。

圖6 初始濃度對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響Fig.6 Effect of initial concentration on biodegradation of DBP and DEHP by AS001 and its growth

圖7 接菌量對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響Fig.7 Effect of inoculum size (V/V) on biodegradation of DBP and DEHP by AS001 and its growth

2.3.4 接菌量對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響

不同接菌量對(duì)菌株AS001生長(zhǎng)及對(duì)DBP和DEHP的降解率影響見圖7?？傮w上，菌株對(duì)DBP的降解率高于對(duì)DEHP的降解率。接菌量為0時(shí)，D600為0.006，菌株對(duì)DBP降解率為8.57%，對(duì)DEHP的降解率為5.53%。作為空白對(duì)照處理，表明自然狀態(tài)下轉(zhuǎn)速等其他因素對(duì)DBP和DEHP的降解率會(huì)有影響，但影響效果較小，突出菌株對(duì)DBP和DEHP的降解效果明顯。接菌量增至1%時(shí)，菌株生長(zhǎng)速度，以及DBP和DEHP的降解率迅速提高；但接菌量由2%增至4%時(shí)，菌株生長(zhǎng)及對(duì)DBP和DEHP的降解率緩慢增加，D600由0.13增加至0.14，對(duì)DBP的降解率由86.05%增長(zhǎng)至96.63%，對(duì)DEHP的降解率由27.06%增長(zhǎng)至35.69%，且兩者降解率均達(dá)到最大；當(dāng)接菌量增加至5%時(shí)，菌株生長(zhǎng)及對(duì)DBP和DEHP的降解率基本穩(wěn)定，DBP的降解率維持在96.6%左右，DEHP的降解率穩(wěn)定在35.6%左右。主要原因是，PAEs作為碳源滿足菌株的生長(zhǎng)，隨著接種量的增加，高濃度菌液中菌體自身的相互競(jìng)爭(zhēng)，使得對(duì)DBP和DEHP的降解能力增加緩慢。

2.3.5 溫度對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響

溫度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的重要因素之一，它能夠通過影響微生物的代謝活動(dòng)，降低酶的活性及DBP和DEHP的溶解度，進(jìn)而影響PAEs的降解效率[30]。菌株AS001對(duì)環(huán)境溫度非常敏感，如圖8所示，總體上，菌株對(duì)DBP的降解率高于對(duì)DEHP的降解率。15 ℃時(shí)，菌株AS001的D600為0.06，對(duì)DBP和DEHP降解率僅為26.19%和23%，隨著溫度升高，其D600和降解率逐漸增加，25～35 ℃時(shí)增加較快，35 ℃時(shí)菌株的D600為0.12，對(duì)DBP和DEHP的降解率也達(dá)到最大，分別為95%和73.65%，降解效果最佳。隨著溫度繼續(xù)升高，菌株的生長(zhǎng)及對(duì)DBP和DEHP的降解率迅速下降，到45 ℃菌株AS001降解能力受到限制，對(duì)DBP和DEHP的降解率僅為18%和16.62%。圖8表明，菌株AS001的最佳培養(yǎng)溫度為30～35 ℃，適宜溫度菌株生長(zhǎng)較快，生物量增加較快，還可以增加DBP和DEHP在水中的溶解度，菌株的可利用碳源得到一定程度的增加，促進(jìn)其生長(zhǎng)；而低溫和高溫時(shí)，菌株基本處于休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)量不高，對(duì)PAEs的降解受到抑制[21]。

圖8 溫度對(duì)AS001生長(zhǎng)及降解DBP和DEHP的影響Fig.8 Effect of temperature on biodegradation of DBP and DEHP by AS001 and its growth

3 結(jié)論

本研究從設(shè)施菜地土壤中分離得到了一株能夠以鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸2-乙基己基酯(DEHP)有機(jī)污染物為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的細(xì)菌AS001，經(jīng)過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列系統(tǒng)學(xué)分析，初步鑒定該菌株為節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)。菌株AS001的生長(zhǎng)及對(duì)DBP和DEHP降解的最適宜條件為：175 r·min-1振蕩培養(yǎng)，pH 7.0，初始濃度100 mg·L-1，接菌量4%，溫度35 ℃。在最佳條件下，菌株AS001能高效利用DBP和DEHP作為碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，對(duì)DBP的降解率明顯高于對(duì)DEHP的降解率。