李春香，蔣 蒨，吳 華，劉俊敏，李 杰

(重慶科瑞制藥(集團(tuán))有限公司，重慶 400060)

隨著人們生活方式的改變，2型糖尿病發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。糖尿病及其并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。二甲雙胍片對(duì)血糖水平起到調(diào)節(jié)作用，在降低患者血糖水平的基礎(chǔ)上，能夠起到規(guī)避低血糖風(fēng)險(xiǎn)的作用，調(diào)節(jié)效果較好[2]。鹽酸二甲雙胍片含量測(cè)定UV法已被《中國(guó)藥典》2015年版二部收錄[3]，高效液相色譜法相較于UV法具有準(zhǔn)確度高、回收率好等優(yōu)點(diǎn)[4-7]。由于鹽酸二甲雙胍片規(guī)格較大(一般為0.25g、0.5g)，在其片劑含量測(cè)定時(shí)，采用液相色譜法常規(guī)進(jìn)樣量10μL或20μL，需要樣品溶液配制時(shí)進(jìn)行二次或多次稀釋至50μg/mL以下[4-7]，增加的多次配制步驟降低了工作效率和測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確度。本方法采用提高樣品溶液進(jìn)樣濃度(140.36～421.08μg/mL)技術(shù)方案，取消溶液二次稀釋過(guò)程，降低進(jìn)樣量至5μL，既防止了二甲雙胍進(jìn)樣量的過(guò)載，又獲得了較佳的色譜峰型和較高的樣品含量檢測(cè)準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，本研究建立的方法專(zhuān)屬性及適用性強(qiáng)，試驗(yàn)效率更高，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，紫外吸收檢測(cè)器(安捷倫科技有限公司)；電子分析天平( Mettler Toledo 公司 XS105、XPE205)； pH計(jì)(Mettler Toledo 公司S210型)。

磷酸二氫鈉(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；戊烷磺酸鈉(天津市復(fù)興精細(xì)化工研究院)；磷酸(成都市科龍化工試劑廠)； 乙腈(Honeywell)；鹽酸二甲雙胍對(duì)照品：(中國(guó)藥品食品檢定研究院 批號(hào)100664-201604，純度100%)；鹽酸二甲雙胍片仿制制劑(規(guī)格0.25g，重慶科瑞制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)20171101、20171102、20171103)；鹽酸二甲雙胍片參比制劑(規(guī)格0.25g 日本新藥株式會(huì)社，批號(hào)355701、356202、356402、357901)；鹽酸二甲雙胍原料藥(山東科源制藥有限公司，批號(hào)P031-1708012 純度99.68%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相：0.005 mol/L磷酸二氫鈉與0.01mol/L戊烷磺酸鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0± 0.05)-乙腈(94∶6)；柱溫：30℃；流速 1.0mL/min；進(jìn)樣量：5μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：233 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取鹽酸二甲雙胍片20片，用研缽研細(xì)，精密稱(chēng)定細(xì)粉適量(相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍28mg)，置于100mL容量瓶中，加水適量，超聲處理10min，放置至室溫，加水稀釋至刻度，制成每1mL含0.28mg鹽酸二甲雙胍的溶液，搖均勻，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取經(jīng)105℃干燥2h的鹽酸二甲雙胍對(duì)照品28mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制成每1mL含0.28mg的溶液，搖均勻，即得。

2.2.3 空白輔料溶液制備

取鹽酸二甲雙胍片空白混合輔料(按處方配比)約15mg，置200mL量瓶加水適量，超聲處理10min，放置至室溫，加水定容至刻度，搖均勻，濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取2.2制備的對(duì)照品、供試品、空白輔料溶液及空白溶劑-水四種溶液，在上述相同液相色譜條件下，進(jìn)樣量5μL，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄圖譜結(jié)果如圖1，從圖中可以看出空白溶劑-水、空白輔料均在主峰位置處不出峰，對(duì)鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定無(wú)干擾。對(duì)照品和供試品圖譜中鹽酸二甲雙胍保留時(shí)間為8.167min，色譜峰峰形尖銳對(duì)稱(chēng)，柱效較高，可見(jiàn)該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

A-空白溶劑-水；B-空白輔料溶液；C-對(duì)照品；D-供試品

圖1 HPLC 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水超聲溶解并稀釋至刻度，制成每1mL中約含2.8mg的溶液作為對(duì)照品貯備液；分別精密量取對(duì)照品貯備液適量，置容量瓶中，加水定容至刻度，搖均勻，同樣方法得到相當(dāng)于對(duì)照品0.28mg/mL濃度的50%、80%、100%、120%、150%系列線性溶液(即濃度分別為140.36μg/mL、224.58μg/mL、280.72μg/mL、336.86μg/mL、421.08μg/mL)，精密量取各線性溶液5μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算，并計(jì)算響應(yīng)因子(A/C)。以濃度 C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出線性方程為：A=17.203C+37.413，r=1.000，線性回歸直線的截距相當(dāng)于限度濃度響應(yīng)值的0.77%，各濃度的響應(yīng)因子相對(duì)偏差RSD為0.34%(n=5)，可以看出在140.36～421.08μg/mL的濃度范圍內(nèi)鹽酸二甲雙胍的濃度與其峰響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”中對(duì)照品溶液5μL，在相同色譜條件下注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄鹽酸二甲雙胍峰保留時(shí)間和峰面積，經(jīng)計(jì)算6次進(jìn)樣所得二甲雙胍峰保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD分別為0.02%和0.12%，小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定和文獻(xiàn)報(bào)道[3，6]，按鹽酸二甲雙胍峰面積計(jì)算得出的理論塔板數(shù)大于1.5萬(wàn)，說(shuō)明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性

按照“2.2.1”與“2.2.2”溶液的配置方法，采用相同色譜條件進(jìn)行測(cè)試，分別考察不同實(shí)驗(yàn)人員使用不同液相色譜儀對(duì)本方法的影響。進(jìn)樣量均為5μL，每組試驗(yàn)采集6份樣品的色譜圖。按外標(biāo)法以鹽酸二甲雙胍峰面積計(jì)算2組試驗(yàn)(12份樣品)的平均含量為100.7%，RSD為0.86%，說(shuō)明本方法具有較好的重復(fù)性。

2.7 回收率試驗(yàn)

供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取原料藥(按照處方比例鹽酸二甲雙胍含量100%計(jì)算，分別稱(chēng)取處方比例含量的0.8倍、1倍與1.2倍各三份，分別記作低濃度、中濃度、高濃度)與空白混合輔料(按配方混合均勻)置同一100mL量瓶中，加入適量水，超聲溶解之后加水稀釋定容至刻度，濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液。對(duì)照品溶液取“2.2.2”中溶液。由測(cè)得量和加入量計(jì)算回收率，結(jié)果如表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

由表1結(jié)果可知，三種不同含量的樣品(分別為處方比例含量的0.8倍、1倍與1.2倍)共9組試驗(yàn)，不同濃度樣品測(cè)定回收率分別為98.62%、98.99%和99.71%，總平均回收率為99.10%，RSD為0.54%，表明利用方法測(cè)定鹽酸二甲雙胍片含量回收率較好，準(zhǔn)確度較高。

2.8 溶液穩(wěn)定性

取“2.2.1”與“2.2.2”中溶液，在常溫條件下放置0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h、24h后分別精密量取5μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積與保留時(shí)間。供試品和對(duì)照品溶液放置24h，鹽酸二甲雙胍測(cè)得的峰面積經(jīng)計(jì)算其RSD分別為1.24%和1.20%，保留時(shí)間RSD分別為0.13%和0.12%，表明此方法配置的供試品溶液和對(duì)照品溶液在24h內(nèi)能夠穩(wěn)定。

2.9 樣品測(cè)定

照“2.2.1”與“2.2.2”配制3批仿制制劑與4批參比制劑，取上述兩種溶液各5μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以鹽酸二甲雙胍峰面積計(jì)算含量。結(jié)果3批仿制制劑(批號(hào)20171101、20171102、20171103)和4批參比制劑(批號(hào)355701、356202、356402、357901)鹽酸二甲雙胍含量分別為101.1%、102.6%、101.6%、101.5%、101.6%、99.2%、102.3%；RSD分別為0.22%、0.50%、0.62%、1.13%、0.42%、0.75%、0.31%。

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)確定：用配制好的供試品溶液和對(duì)照品溶液在200～400nm范圍內(nèi)掃描，對(duì)照品和供試品溶液在233nm處有最大吸收峰，對(duì)比溶劑-水和輔料對(duì)測(cè)試峰無(wú)干擾，故將檢測(cè)波長(zhǎng)定為233nm。

流動(dòng)相選擇：通過(guò)多種試劑的比較和選擇，本方法制備的0.005 mol/L磷酸二氫鈉與0.01mol/L戊烷磺酸鈉流動(dòng)相溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0± 0.05)-乙腈(94∶6)排除了溶劑和輔料等物質(zhì)對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾。所測(cè)樣品理論塔板數(shù)大于1.5萬(wàn)(按鹽酸二甲雙胍峰計(jì)算)，基線平穩(wěn)且圖譜峰型對(duì)稱(chēng)性較好，最大峰值保留時(shí)間為8.167min，說(shuō)明該技術(shù)方案樣品含量測(cè)定分離效果較好。

原國(guó)家注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定方法由試驗(yàn)證明回收率較低，影響了鹽酸二甲雙胍藥品生產(chǎn)過(guò)程各工序藥品含量折算準(zhǔn)確度[8]。故本研究采取超聲溶解提高樣品溶液濃度(140.36～421.08μg/mL)和減少進(jìn)樣量(5μL)的技術(shù)方案，取消了大規(guī)格樣品溶液配制多次稀釋溶解過(guò)程，減少了多次稀釋操作等過(guò)程人為因素對(duì)鹽酸二甲雙胍片含量測(cè)定準(zhǔn)確度影響。在鹽酸二甲雙胍片生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)品控制與成品檢驗(yàn)中，經(jīng)優(yōu)化了的HPLC鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定方法樣品回收率達(dá)到了99.10%，RSD為0.54%，與理論投料量具有高度的吻合性。經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察，表明該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確靈敏，重復(fù)性好，有效的提高了鹽酸二甲雙胍片含量測(cè)定的質(zhì)量控制準(zhǔn)確性。