劉曉禮 王 昊 張東玥 王麗娜 鄭國光

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津300020)

IL-34是2008年發(fā)現(xiàn)的一種新型白細(xì)胞介素[1]，與巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF/CSF1)作用于同一受體CSF1R[2]。IL-34與M-CSF功能有顯著重疊，均可促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及破骨細(xì)胞的增殖、分化和生存[3,4]。然而二者表達(dá)具有時(shí)空差異[5,6]，且在基因序列和結(jié)構(gòu)上缺少同源性[7,8]，導(dǎo)致功能亦存在差異。有研究報(bào)道，IL-34 和 M-CSF均可誘導(dǎo)免疫抑制型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生[9]，但兩種巨噬細(xì)胞在分泌細(xì)胞因子及M1/M2極化方面存在差異[10]。目前IL-34 和 M-CSF在病理和生理?xiàng)l件下的功能差異并未完全闡明。本文通過體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，研究兩者在巨噬細(xì)胞分化過程中的作用差異。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 8～10周雌性C57BL/6J小鼠購自實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動物中心。α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素均購自Gibco公司，重組鼠源M-CSF和IL-34均購于PeproTech公司，TRIzol購自Thermo公司。流式抗體CD11b-PerCp-Cy5.5和Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購于BD公司，F(xiàn)4/80-APC購于eBioscience公司。引物在華大基因科技股份有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1骨髓細(xì)胞培養(yǎng) 取小鼠股骨和脛骨髓腔內(nèi)細(xì)胞，ACK裂解液裂解紅細(xì)胞后，按1.5×106個/孔均勻鋪于12孔板中，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)。在骨髓細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度(50、100或150 ng/ml)IL-34和50 ng/ml M-CSF作用骨髓細(xì)胞3或6 d；在巨噬細(xì)胞表型維持實(shí)驗(yàn)中，先用50 ng/ml M-CSF誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞6 d后，再分別用50 ng/ml M-CSF、100 ng/ml IL-34、100 ng/ml LPS和無因子(對照組)條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d。分別在3、6和9 d取細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)檢測。細(xì)胞每3 d換一次液，在第3天換液時(shí)，保留懸浮細(xì)胞；第6天換液時(shí)，棄懸浮細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)觀察 將培養(yǎng)3、6和9 d的細(xì)胞置倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄形態(tài)。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型 棄培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞，用刮刀刮取法收集貼壁細(xì)胞，PBS洗1次，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)后，用1∶100的抗體稀釋液重懸細(xì)胞，避光冰浴30 min 后，用PBS洗去未結(jié)合的抗體并重懸，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞表面分子表達(dá)水平，并設(shè)置未標(biāo)抗體的陰性對照組，采用FlowJo10軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4RT-PCR法檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因表達(dá) 收集貼壁細(xì)胞，用PBS清洗1次，TRIzol法提取總RNA,測定RNA濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參對照，RT-PCR法測定M-CSF和IL-34誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平(引物序列詳見表1)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，循環(huán)48次終止反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算極化相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Annexin-V/PI法檢測細(xì)胞凋亡 收集貼壁細(xì)胞，用Annexin-V-結(jié)合緩沖液重懸后加抗體Annexin-V-FITC，室溫避光15 min，加入PI用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比例，采用FlowJo10軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1IL-34對巨噬細(xì)胞增殖的作用 用不同濃度(50、100或150 ng/ml) IL-34和50 ng/ml M-CSF作用于骨髓細(xì)胞，3 d后，各組均出現(xiàn)帶偽足的細(xì)胞，其形態(tài)無顯著差異(圖1A)。流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，因子處理組CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞的比例和絕對數(shù)均顯著高于對照組(均P<0.001)，而100 ng/ml IL-34組與M-CSF組比較差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同濃度IL-34組間比較發(fā)現(xiàn)，隨IL-34濃度增大巨噬細(xì)胞絕對數(shù)顯著增高(均P<0.01；圖1B、C)。作用6 d后，懸浮細(xì)胞大部分凋亡，呈長梭形貼壁細(xì)胞的比例增多，流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)變化趨勢與3 d時(shí)基本一致(圖1A、D、E)。

表1 RT-PCR引物序列

Tab.1 Sequence of RT-PCR primers

GeneForwardReverseGAPDH5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATT-3′5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′IL-12β5′-ATGTGGAATGGCGTCTCTGTCT-3′5′-TGGGCGGGTCTGGTTTGA-3′iNOS5′-CAGCGGAGTGACGGCAAAC-3′5′-AGACCAGAGGCAGCACATCAA-3′Arg15′-CAACCAGCTCTGGGAATCTG-3′5′-AATCGGCCTTTTCTTCCTTC-3′Mmp95′-TGAGTCCGGCAGACAATCCT-3′5′-CCCTGGATCTCAGCAATAGCA-3′IL-105′-CCAGAGCCACATGCTCCTA-3′5′-AGGGGAGAAATCGATGACAG-3′CXCL115′-AGCTGCTCAAGGCTTCCTTA-3′5′-AGTAACAATCACTTCAACTTTGTCG-3′IL-1β5′-TGCCACCTTTTGACAGTGAT-3′5′-TGTCCTCATCCTGGAAGGTC-3′TNF-α5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′5′-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3′CD2065′-CCTGAACAGCAACTTGACCA-3′5′-GCAATGGCCATAGAAAGGAA-3′CSF-15′-TCACAACCTCATCCTTCTGCG-3′5′-GACCCAGTTAGTGCCCAGTGA-3′

從以上結(jié)果可得出，IL-34與M-CSF均可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，IL-34的作用呈劑量依賴性，兩者誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在形態(tài)上無顯著差異。

2.2IL-34對巨噬細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記表達(dá)的作用 因子作用3 d后，IL-34組巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11b和F4/80表達(dá)強(qiáng)度顯著低于M-CSF組，峰值左移(圖2A)；不同濃度的IL-34組MFI均顯著低于M-CSF組(均P<0.05)；而3個濃度的IL-34組之間CD11b的 MFI差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B、C)。作用6 d后，結(jié)果同3 d時(shí)一致，IL-34組CD11b和F4/80表達(dá)強(qiáng)度也低于M-CSF組，并且峰值左移更顯著，MFI的變化與3 d時(shí)一致(圖2D、E、F)。從以上結(jié)果得出，IL-34與M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在分化表型上存在差異。

2.3IL-34對巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因表達(dá)的作用 為探究IL-34與M-CSF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，利用RT-PCR方法分析M1型極化相關(guān)基因[IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、C-X-C motif趨化因子11(C-X-C motif chemokine 11，CXCL11)、IL-12β和TNF-α]和M2型極化相關(guān)基因[細(xì)胞分化抗原206(Cluster of Differentiation 206，CD206)、IL-10、精氨酸1 (Arginase 1，Arg1)、CSF-1和基質(zhì)金屬蛋白酶9 (Matrix metallopeptidase 9，Mmp9)]的表達(dá)情況。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-34誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的IL-1β、iNOS和IL-10表達(dá)高于M-CSF組(IL-1β,P<0.05;iNOS,P<0.05；IL-10,P<0.01)，而IL-12β表達(dá)低于M-CSF組(P<0.01；圖3A、B)。以上結(jié)果表明，IL-34與M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在M1型和M2型極化相關(guān)基因表達(dá)上存在差異。

2.4IL-34對M-CSF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化標(biāo)記的作用 M-CSF誘導(dǎo)6 d的巨噬細(xì)胞，用IL-34作用3 d后，CD11b和F4/80的峰值顯著左移(圖4A)；且兩者的MFI均顯著低于M-CSF維持組(CD11b，P<0.05；F4/80，P<0.01)；相同的細(xì)胞用LPS刺激3 d后，CD11b和F4/80的MFI 均顯著高于M-CSF維持組(CD11b，P<0.05； F4/80，P<0.01；圖4B、C)。以上結(jié)果進(jìn)一步表明IL-34作用后巨噬細(xì)胞的分化表型與M-CSF存在差異。

2.5IL-34對M-CSF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖的作用 取M-CSF誘導(dǎo)6 d的巨噬細(xì)胞，分別在50 ng/ml M-CSF、 100 ng/ml IL-34、 100 ng/ml LPS或未加因子(對照組)條件下培養(yǎng)3 d。IL-34組與M-CSF組比較發(fā)現(xiàn)，IL-34可維持巨噬細(xì)胞的形態(tài)、比例和數(shù)量(圖5A～C)，并且凋亡情況比較差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5D)；而LPS刺激后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由偏M2型的長梭形變?yōu)槠玀1型的煎蛋樣形狀(圖5A)，巨噬細(xì)胞比例差異雖無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)，但絕對數(shù)有降低趨勢(圖5C)，早期凋亡顯著增高(P<0.01，圖5D)。以上結(jié)果表明，IL-34可維持巨噬細(xì)胞的生存，進(jìn)一步證明IL-34和 M-CSF在促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖能力上差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 IL-34與M-CSF對巨噬細(xì)胞分化表型的作用Fig.2 Effects of IL-34 and M-CSF on differentiation phenotype of macrophageNote: A.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 3；B and C.MFI of CD11b (B) and F4/80 (C) on day 3；D.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 6；E and F.MFI of CD11b (E) and F4/80 (F) on day 6.*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001.

圖3 IL-34與M-CSF對巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因表達(dá)的作用Fig.3 Effects of IL-34 and M-CSF on expression of macrophage polarization related genesNote: A.The expression of M1 type polarization related genes in macrophages induced for 6 days；B.The expression of M2 type polarization related genes in macrophages induced for 6 days.*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 IL-34對M-CSF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化的作用Fig.4 Effects of IL-34 on M-CSF induced differentiation of macrophagesNote: A.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 9；B and C.MFI of CD11b (B) and F4/80 (C) on day 9.*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 IL-34對M-CSF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Effects of IL-34 on M-CSF induced macrophage proliferation and apoptosisNote: A.Morphology of bone marrow derived cells on day 9；B and C.the proportion (B) and absolute number (C) of macrophages on day 9；D.the apoptosis was measured by Annexin-V/PI staining.*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要成員，參與眾多生理、病理過程，其功能異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，因此探索巨噬細(xì)胞在不同疾病條件下的功能異常以及如何使用干預(yù)后的巨噬細(xì)胞進(jìn)行疾病治療成為研究的熱點(diǎn)。穩(wěn)定且易操作的體外獲取巨噬細(xì)胞的方法是相關(guān)研究的前提，M-CSF和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF)是體外由單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞的常用因子，GM-CSF誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞具有更多M1型的性質(zhì)，而M-CSF誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞具有更多M2型的性質(zhì)[11]。體外誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞有多方面的用途，一方面用于體內(nèi)、體外相關(guān)機(jī)制研究；另一方面經(jīng)過進(jìn)一步體外處理后回輸體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞治療，如在腎臟移植中，將供者的巨噬細(xì)胞輸注給受者，可提高移植器官的存活并發(fā)揮一定的免疫抑制作用[12]。最近有研究通過慢病毒感染在巨噬細(xì)胞導(dǎo)入嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)，獲得CAR-吞噬細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞的靶向吞噬能力[13]。IL-34誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞與M-CSF誘導(dǎo)的相似，偏向M2型性質(zhì)，但有研究表明兩者誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞并不完全一致，功能和表型上的區(qū)別尚未闡明。本文旨在豐富巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)體系，并為巨噬細(xì)胞應(yīng)用提供有益的線索。

IL-34主要通過結(jié)合CSF1R發(fā)揮促進(jìn)單核細(xì)胞增殖、分化和極化的作用[6,14]，目前研究顯示IL-34和M-CSF兩配體分別與CSF1R結(jié)合后，激活的下游信號通路并無顯著差異[10,14]。雖然兩者在支持巨噬細(xì)胞生長和存活上能力相當(dāng)，但在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和嗜酸粒細(xì)胞趨化因子等細(xì)胞因子能力以及遷移能力上均存在差異[14]。除CSF1R外，IL-34還有另外兩個選擇性受體，受體型蛋白-酪氨酸磷酸酶ζ (Protein-tyrosine phosphatase zeta,PTP-ζ)和Syndecan-1(CD138)[15，16]，這也進(jìn)一步暗示IL-34與M-CSF的功能可能并不完全重疊。盡管如此，目前仍未完全闡明IL-34與M-CSF功能上的差異。

之前研究發(fā)現(xiàn)，用IL-34和M-CSF誘導(dǎo)外周單核細(xì)胞，均可得到免疫抑制型巨噬細(xì)胞(IL-10highIL-12low)[17]。本研究利用IL-34與M-CSF刺激小鼠骨髓細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者在促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖和存活上功能類似，均能誘導(dǎo)出呈長梭形的偏M2型的巨噬細(xì)胞。但進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)IL-34誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞仍存在差異。與M-CSF組對比，IL-34誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的分化標(biāo)志物CD11b和F4/80的表達(dá)強(qiáng)度較弱，且隨著IL-34誘導(dǎo)濃度的增加有降低的趨勢；該現(xiàn)象在用IL-34培養(yǎng)M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞時(shí)也同樣出現(xiàn)，IL-34作用后巨噬細(xì)胞CD11b和F4/80的表達(dá)強(qiáng)度弱于用M-CSF維持組。綜上，IL-34與M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在分化表型存在差異。

巨噬細(xì)胞本身具有很強(qiáng)的異質(zhì)性和可塑性[18,19]，不同因子將其極化為不同狀態(tài)，故其功能也存在差異[20]。有研究表明，分別由IL-34與M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞再經(jīng)LPS + IFNγ 或IL-4刺激活化后，M1和M2的表型不完全相同，對T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的活化也存在差異[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-34與M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1型和M2型極化相關(guān)基因的表達(dá)也并不完全一致。與M-CSF組對比，IL-34誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-1β、iNOS和IL-10的表達(dá)水平較高，而IL-12β的表達(dá)水平較低，這說明IL-34與M-CSF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)本身就存在差異。

IL-34的表達(dá)水平對機(jī)體的穩(wěn)態(tài)有重要意義，異常表達(dá)與多種疾病相關(guān)[2]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，IL-34表達(dá)升高一方面可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫病相關(guān)[3,21]；另一方面可募集M2性質(zhì)的巨噬細(xì)胞，抑制免疫反應(yīng)，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[3,22]。IL-34在機(jī)體中的功能具有爭議[3]，尚未研究透徹，仍需要不斷地探究。本課題通過研究IL-34與M-CSF對巨噬細(xì)胞分化的作用，證實(shí)IL-34與M-CSF雖然結(jié)合同一受體CSF1R,但功能仍存在一定差異,為采用IL-34或M-CSF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，也暗示了IL-34與M-CSF在生理和病理環(huán)境中調(diào)控的復(fù)雜性，為與IL-34、M-CSF相關(guān)的疾病治療提供思路。