徐忠誠，辛俊舟，吳磊，劉紅陽，王麗△

心力衰竭的重要病理特征是交感-腎上腺素系統(tǒng)過度激活，其表現(xiàn)為血漿兒茶酚胺水平增加和交感神經(jīng)持續(xù)激活。β-腎上腺素受體（β-adrenergic receptor，β-AR）作為典型的心臟腎上腺素受體，在代償性心臟重塑中介導(dǎo)交感神經(jīng)激活引起正性肌力作用，并在失代償性心臟重構(gòu)的進(jìn)展中起重要作用。β3-腎上腺素受體（β3-adrenergic receptor，β3-AR）是β-AR的一種亞型受體，與β1-AR、β2-AR同屬于具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，并參與心力衰竭的病理生理過程。在心力衰竭過程中，β1-AR在持續(xù)激活后發(fā)生顯著“減敏”和下調(diào)；β2-AR雖然在蛋白水平保持不變，但其所依賴的傳導(dǎo)信號從Gs轉(zhuǎn)變成Gi途徑［1］。與之相反，β3-AR由于缺乏蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）和G蛋白偶聯(lián)受體激酶（G protein-coupled receptor kinases，GRK）的磷酸化位點而不易發(fā)生受體“減敏”現(xiàn)象，從而在心力衰竭時持續(xù)發(fā)揮作用［2-3］。

與β1-AR、β2-AR在心臟中的作用不同，β3-AR在心臟中主要與Gi蛋白相偶聯(lián)，并通過NO合成酶/環(huán)磷酸鳥苷/蛋白激酶G（NOS/cGMP/PKG）途徑引起負(fù)性肌力作用，并且隨著心力衰竭的不斷加重，負(fù)性肌力作用逐漸增強(qiáng)［4-5］。已有研究表明，在心力衰竭大鼠模型和臨床患者的心臟組織中β3-AR表達(dá)均明顯增加［6-7］。在快速心房起搏引起心房顫動的家兔心力衰竭模型中，β3-AR表達(dá)也明顯增加［8］。但是，心力衰竭時心肌組織的β3-AR表達(dá)增加主要來自心肌細(xì)胞還是心臟成纖維細(xì)胞尚不清楚。為此，本研究分離培養(yǎng)Sprague-Dawley（SD）乳鼠原代心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞，模擬參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展的兩個主要病理系統(tǒng)的激活，分別給予血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）及去甲腎上腺素（Noradrenaline，NE）進(jìn)行刺激，然后檢測這兩種細(xì)胞中β3-AR mRNA的表達(dá)變化，以此判斷病理刺激對心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞β3-AR表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 出生1～3日齡的SPF級SD乳鼠，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，動物倫理批準(zhǔn)號為：LA2010-035。胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖達(dá)氏改良伊格爾（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，雙聯(lián)抗生素（青霉素、鏈霉素）購自美國HyClone公司，牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）、40 g/L多聚甲醛、Triton X-100、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxyuridine，Brdu）、AngⅡ、NE和小鼠抗輔肌動蛋白（α-actinin）單克隆抗體購自美國Sigma公司，兔抗波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體購自美國CST公司，Alexa Fluor?594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG、Alexa Fluor?488標(biāo)記的驢抗兔IgG、hoechst33342染色液、TRIzol購自美國Invitrogen公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS）、逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）引物序列均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將10只1～3日齡的SD乳鼠用75%的乙醇浸泡消毒后，立即于超凈工作臺中開胸取出心臟，置于盛有預(yù)冷PBS的玻璃皿中清洗2次。剔除心耳和大血管等組織，用小鑷子將心臟移到10 mL的消化瓶中，用小剪刀快速剪碎心室成小塊，滴加適量PBS洗去殘血。加入用HBSS配制的消化液（含0.07%胰蛋白酶和0.04%Ⅱ型膠原酶）進(jìn)行消化。整個消化過程在37℃恒溫攪拌條件下進(jìn)行，每消化4 min后吸取消化瓶中的上清液，加入到等量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，輕輕吹打混合均勻。重復(fù)該過程約7～8次直到組織塊消化完全，將收集的細(xì)胞懸液于室溫離心6 min，離心時重力加速度為9×g，棄上清，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，合并每次所得細(xì)胞懸液，接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2 h使心臟成纖維細(xì)胞完全貼壁。然后吸取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液至80 mL的燒杯中，根據(jù)實驗需求稀釋至相應(yīng)體積，再按1∶100的比例加入Brdu，輕輕吹打混勻后接種到相應(yīng)的培養(yǎng)板中，待心肌細(xì)胞貼壁及心臟成纖維細(xì)胞傳至第1代時即可進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 免疫熒光鑒定SD乳鼠心肌細(xì)胞（Neonatal rat cardiomyocytes，NRCM）和SD乳鼠心臟成纖維細(xì)胞（Neonatal rat cardiac fibroblast，NRCF） 將原代心肌細(xì)胞以3×105/mL的密度接種于3.5 cm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后用PBS清洗3次；多聚甲醛（40 g/L）室溫固定細(xì)胞15 min，PBS清洗殘余固定液；0.25%Triton X-100透化各組細(xì)胞30 min；用含4%BSA溶液于室溫封閉30 min；棄去封閉液后加入小鼠抗α-actinin抗體并放入濕盒4℃孵育過夜；第2天加入Alexa Fluor?594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG熒光二抗避光室溫孵育1 h，然后加入DNA染料hoechst染核5 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察顯色程度并拍照記錄，心肌細(xì)胞免疫熒光陽性結(jié)果為肌絲呈紅色。心臟成纖維細(xì)胞的免疫熒光鑒定一抗用兔抗Vimentin單克隆抗體，二抗加入Alexa Fluor?488標(biāo)記的驢抗兔IgG，具體操作方法同上，其陽性結(jié)果為細(xì)胞骨架呈綠色。

1.4 細(xì)胞分組與處理 NRCM和NRCF均設(shè)對照組和處理組，對照組正常培養(yǎng)，不作處理；處理組分別用AngⅡ（AngⅡ組，10-6mol/L）來模擬腎素-血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）激活狀態(tài)，用NE（NE組，10-5mol/L）來模擬交感神經(jīng)系統(tǒng)（sympathetic nervous system，SNS）過度興奮狀態(tài)。48 h后，分別收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。每次實驗獨立重復(fù)6次。

1.5 qPCR檢測心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因、心臟成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因及β3-AR的mRNA表達(dá) 用TRIzol提取NRCM及NRCF的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將已提取的RNA（1μg/樣品）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行qPCR操作。擴(kuò)增條件為95℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，設(shè)置40個循環(huán)。用GAPDH做為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法比較目的基因的表達(dá)差異。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences used in qPCR analysis表1 qPCR所用的引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0和SPSS 24.0進(jìn)行作圖和統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或校正t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)鑒定及基礎(chǔ)狀態(tài)下β3-AR的表達(dá) 剛分離的NRCM呈圓形或橢圓形，懸浮于培養(yǎng)液中，2 h時開始貼壁，24 h時可見存活的細(xì)胞完全貼壁；呈星型、梭形、多邊形等多種形態(tài)；鏡下可見細(xì)胞有明顯的自發(fā)性搏動，搏動頻率80～120次/min。48 h時心肌細(xì)胞偽足相互交聯(lián)、聚集成簇。NRCF在30 min時即開始貼壁，至2 h時已基本完全貼壁。無自發(fā)性搏動，24 h時細(xì)胞形態(tài)呈梭形、多邊形等形態(tài)。胞核較大，胞質(zhì)透明。NRCF生長迅速，48 h即可鋪滿培養(yǎng)皿的90%。細(xì)胞免疫熒光染色可見NRCM肌絲α-actinin表達(dá)陽性，NRCF細(xì)胞骨架Vimentin表達(dá)陽性，證實NRCM和NRCF分離培養(yǎng)成功，見圖1。同時，無論是在正常的NRCM上還是在正常的NRCF上，β3-AR mRNA的表達(dá)水平都很低，但NRCM組中β3-AR mRNA的表達(dá)水平明顯高于NRCF組（0.001 10±0.000 27vs.0.000 10±0.000 04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=12，t=12.375，P＜0.05）。

2.2 AngⅡ刺激下NRCM肥大相關(guān)基因及β3-AR的表達(dá)情況 NRCM中AngⅡ組ANP、BNP、β-MHC以及β3-AR mRNA表達(dá)水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表2。

Fig.1 Morphological identification of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts圖1 心肌細(xì)胞與心臟成纖維細(xì)胞的形態(tài)鑒定

Tab.2 Expression levels of hypertrophy related genes and β3-AR mRNA in NRCM表2 NRCM中肥大相關(guān)基因及β3-AR mRNA的表達(dá)水平

2.3 AngⅡ刺激下NRCF表型轉(zhuǎn)化及β3-AR的表達(dá)情況 NRCF中AngⅡ組COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。NRCF中AngⅡ組β3-AR mRNA表達(dá)水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 NE刺激下NRCM肥大及β3-AR的表達(dá)情況 NRCM中NE組ANP、BNP、β-MHC以及β3-AR mRNA表達(dá)水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表4。

2.5 NE刺激下NRCF表型轉(zhuǎn)化及β3-AR的表達(dá)情況 NRCF中NE組COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表達(dá)水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。NE組β3-AR mRNA表達(dá)水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

Tab.3 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表3 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表達(dá)量（±s）

Tab.3 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表3 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表達(dá)量（±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組AngⅡ組t n6 6 COL-ⅠmRNA 26.868±3.305 43.597±6.705 5.482＊＊COL-ⅢmRNA 12.520±1.979 35.401±4.538 11.321＊＊β3-AR mRNA 0.000 10±0.000 03 0.000 20±0.000 06 1.936

Tab.4 Expression levels of hypertrophy related genes and β3-AR mRNA in NRCM表4 NRCM中肥大相關(guān)基因及β3-AR mRNA的表達(dá)水平

Tab.5 Expression levels of COL-I,COL-III and β3-AR mRNA in NRCF表5 NRCF中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及β3-AR mRNA的表達(dá)量

3 討論

本研究結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的NRCM及NRCF中β3-AR表達(dá)量均很低，但兩者相比，NRCM中β3-AR的表達(dá)量要明顯高于NRCF。同時，分別在AngⅡ及NE的誘導(dǎo)下，NRCM肥大相關(guān)基因表達(dá)增加的同時β3-AR的表達(dá)也明顯增加；而在同樣條件的AngⅡ及NE的誘導(dǎo)下，NRCF雖然發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化但β3-AR的表達(dá)并沒有明顯變化。由此推測，參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理因素AngⅡ和NE主要引起心肌細(xì)胞的β3-AR表達(dá)增加，而不是心臟成纖維細(xì)胞。

正常心臟組織中β3-AR表達(dá)量相對較少，僅占到β-AR的2%～3%左右［9］。同時，由于β3-AR與內(nèi)源性兒茶酚胺的親和力較低，在正常生理條件下幾乎不發(fā)揮活性作用［10-11］。但在心力衰竭時，交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)激活，引起兒茶酚胺產(chǎn)生增多［12］。高濃度的兒茶酚胺激活β3-AR并通過環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）依賴性信號通路增加蛋白激酶G（PKG）的活性而對心臟調(diào)節(jié)起到負(fù)性肌力作用，由于β3-AR在分子結(jié)構(gòu)上的特異性導(dǎo)致其不易發(fā)生受體“減敏”現(xiàn)象，因而隨著兒茶酚胺的不斷增加，其介導(dǎo)負(fù)性肌力作用逐漸增強(qiáng)［13］。Rozec等［14］研究表明β3-AR激活后產(chǎn)生的負(fù)性肌力作用可以降低心肌收縮力、減少心肌做功和耗氧量，從而抵抗β1-AR、β2-AR過度激活所引起的心臟損傷作用。

然而，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使大鼠心臟過表達(dá)人β3-AR后，給予β3-AR特異性的激動劑BRL37344產(chǎn)生正性肌力作用，而這一正性肌力作用是β3-AR與Gs蛋白相偶聯(lián)并活化腺苷酸環(huán)化酶及其下游相關(guān)信號所介導(dǎo)的［15］。Mulder等［16］發(fā)現(xiàn)β3-AR激動劑奈必諾爾（nebivolol）并不能改善心力衰竭并發(fā)房顫患者的心臟功能。同時，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)β3-AR激活后可通過TGF-β/Smad信號通路介導(dǎo)心臟纖維化，促進(jìn)心肌重構(gòu)[17]。這與Sheng等［18］在用快速起搏誘導(dǎo)心房顫動的犬心力衰竭模型中發(fā)現(xiàn)，β3-AR表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激和惡化心臟重構(gòu)的結(jié)果相一致。

上述研究結(jié)果的不同可能與樣本選擇、模型制備及檢測方法等條件的不同有關(guān)。但是，β3-AR在心力衰竭的心臟中表達(dá)上調(diào)的結(jié)果卻是一致的。Moniotte等［7］研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者心臟組織中β3-AR的表達(dá)較正常對照組明顯升高；Miao等［19］研究發(fā)現(xiàn)在主動脈縮窄術(shù)所致大鼠心力衰竭的心肌組織中β3-AR表達(dá)也明顯升高。有研究報道在正常心臟心室肌內(nèi)膜和外膜β3-AR表達(dá)無明顯差異，但在心房中的表達(dá)高于心室［20］。心力衰竭時，β3-AR表達(dá)上調(diào)的確切病理生理效應(yīng)還有爭議，亟待進(jìn)行更加深入、更有針對性的研究來進(jìn)行明確。

心力衰竭發(fā)生的機(jī)制主要是神經(jīng)體液因素的改變，如交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活和細(xì)胞因子水平失衡等，其病理生理基礎(chǔ)為心臟重塑，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化和神經(jīng)體液調(diào)節(jié)中相關(guān)細(xì)胞因子的改變。為了更有針對性地檢測心力衰竭時β3-AR的表達(dá)情況，本研究分離培養(yǎng)NRCM和NRCF，并模擬參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展的兩個主要病理系統(tǒng)的激活。結(jié)果顯示，在AngⅡ所誘導(dǎo)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活狀態(tài)，NRCM中β3-AR表達(dá)明顯增加，而NRCF中β3-AR表達(dá)沒有明顯變化；在NE所誘導(dǎo)的交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮狀態(tài)，NRCM中β3-AR表達(dá)也明顯增加，但NRCF中β3-AR表達(dá)無明顯變化，提示AngⅡ和NE作為參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理因素主要引起NRCM中的β3-AR表達(dá)，而不是NRCF。因為心肌中NRCF的數(shù)量要遠(yuǎn)多于NRCM，但含有的β3-AR的量卻極少，即使是在病理狀態(tài)下也未見明顯增加。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探討β3-AR參與心力衰竭病理生理效應(yīng)的具體作用提供了工作基礎(chǔ)，也為β3-AR在心力衰竭中的研究提供新的思路。