陳喜娟，胡立娟，邱帥，楊靜，謝俊木子，王豐△

胰腺癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，由于發(fā)病隱匿，確診時多已錯過最佳治療時期，加之其對放、化療不敏感，導致5年生存率低于8%［1］。最近美國癌癥協(xié)會研究表明，2018年美國將有新發(fā)胰腺癌病例近5萬人，因胰腺癌死亡的近4萬人［2-3］，預計到2030年胰腺癌將成為美國第2大癌癥死亡原因［4］。在我國，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率也呈上升態(tài)勢，且每年的死亡率幾乎等于發(fā)病率［5］。缺氧誘發(fā)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著調(diào)控作用。缺氧不僅能加快腫瘤細胞增殖與存活，還能加快腫瘤細胞的能量代謝［6-8］，使腫瘤細胞對放療、化療的敏感性降低。人或其他哺乳動物細胞一般通過氧化磷酸化獲取能量，而癌細胞則不同，即使在氧氣充足的條件下，也主要依靠糖酵解來獲取能量，癌細胞的這一特性稱為瓦博格效應。β-五沒食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-penta-o-galloyl-β-D-glucose,β-PGG）是一種天然的單寧多酚類化合物，由5個沒食子?；M成，其核心為葡萄糖，具有抗炎、抗癌、降血糖、抗氧化等多種生物學效應［9］。但是，有關β-PGG對人胰腺癌MiaPaCa-2細胞影響方面的研究尚鮮見報道，本研究旨在探討β-PGG對人胰腺癌MiaPaCa-2細胞的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2（#CC2408）購自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自天潤善達公司，胎牛血清購自以色列Bioind公司，β-PGG購自美國Sigma公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司。Western bolt檢測中使用的兔源HIF-1α多克隆抗體購自美國Novus公司，兔源葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 1（glucose transporter 1，GLUT1）單克隆抗體購自美國Abcam公司，鼠源磷酸果糖激酶（fructose phosphate kinase，PFK）單克隆抗體、羊源己糖激酶-Ⅱ（hexokinase-Ⅱ，HK-Ⅱ）多克隆抗體和鼠源β-tubulin單克隆抗體均購自美國Sanata Cruz公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔抗體和山羊抗小鼠抗體購自上海良森生物科技有限公司，小鼠抗山羊抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。葡萄糖乳酸試劑盒購于南京建成生物技術有限公司，CCK-8增殖毒性檢測試劑盒購于北京碧云天公司，增強化學發(fā)光底物檢測試劑盒購于美國Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胰腺癌MiaPaCa-2細胞用含10%的胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測β-PGG對MiaPaCa-2胰腺癌細胞增殖的作用 取對數(shù)生長期的MiaPaCa-2細胞用0.25%胰酶消化，制成細胞懸液，接種于96孔板，每孔5 000個細胞，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制β-PGG，使其終濃度分別為5、25、50、100 μmol/L，棄掉細胞上清液，于每孔加配好的藥液100μL，每個濃度設5個復孔，以不含β-PGG培養(yǎng)基的細胞作為陰性對照。分別孵育24、48、72 h后，于每孔直接加入10μL CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h后在酶標儀450 nm處測定各孔的光密度（OD）值。按以下公式計算細胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-實驗孔OD值/對照孔OD值）×100%。

1.2.3 乳酸試劑盒檢測β-PGG對乳酸生成的影響 取對數(shù)生長期的MiaPaCa-2細胞用0.25%胰酶消化，制成細胞懸液，接種于6孔板，37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁生長融合至80%時，用含5.6 mmol/L葡萄糖的KH buffer配制β-PGG，使其終濃度分別為5、50μmol/L，常氧（5%CO2和95%空氣、37 ℃）和缺氧（1%O2、5%CO2、94%N2、37℃）條件下孵育細胞4 h，收集上清液，細胞裂解后測定蛋白濃度。按照乳酸試劑盒說明書檢測上清液中乳酸的濃度。因KH buffer中除葡萄糖外不含其他可生成乳酸的物質(zhì)，測得的乳酸均來自葡萄糖的酵解，即為乳酸的生成量。為抵消細胞群落大小不一可能給實驗結果帶來的影響，全部結果均先行用同組細胞總蛋白量進行修正。

1.2.4 蛋白印跡法檢測β-PGG對HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK表達的影響 用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制β-PGG，使其終濃度分別為5、13、25、50、100 μmol/L，缺氧條件下（1%O2、5%CO2、94%N2、37 ℃）處理細胞4 h，裂解細胞，收集蛋白。取20μg蛋白于SDS-PAGE電泳，蛋白印跡檢測HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK的表達。一抗孵育過夜，二抗孵育2 h，以β-tubulin作為內(nèi)參，增強化學發(fā)光底物試劑盒檢測曝光，應用NIH Image J軟件進行分析，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白的灰度值作為蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計分析軟件包SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β-PGG對MiaPaCa-2胰腺癌細胞增殖的抑制作用 CCK-8結果顯示，不同濃度的β-PGG（5、25、50、100μmol/L）均能有效抑制MiaPaCa-2細胞的增殖，且抑制作用隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長而增強，呈現(xiàn)出劑量依賴性和時間依賴性，見表1。

Tab.1 The effects of β-PGG on cell proliferation in human pancreatic cancer Miapaca2 cell line detected by CCK-8 method表1 CCK-8法檢測β-PGG對Miapaca2體外增殖抑制率的影響 （%，±s）

Tab.1 The effects of β-PGG on cell proliferation in human pancreatic cancer Miapaca2 cell line detected by CCK-8 method表1 CCK-8法檢測β-PGG對Miapaca2體外增殖抑制率的影響 （%，±s）

＊＊P＜0.01；同一時點組間，a與對照組比較，b與5 μmol/L組比較，c與25μmol/L組比較，P＜0.05；組內(nèi)不同時點，A與24 h組比較，B與48 h組比較，P＜0.05

組別對照組5μmol/L組25μmol/L組50μmol/L組100μmol/L組F 24 h(n=4)0 17.72±7.12a 47.02±5.72ab 56.32±1.22abc 61.33±5.07abc 126.822＊＊48 h(n=4)0 36.79±16.51a 74.06±1.64abA 75.06±3.45abA 79.64±1.70abA 81.265＊＊72 h(n=3)0 37.38±16.16a 80.14±3.69abA 82.82±1.27abAB 82.97±0.78abA 74.575＊＊F-2.551 68.992＊＊124.055＊＊46.366＊＊-

2.2 β-PGG對MiaPaCa-2胰腺癌細胞乳酸生成的影響 無論在常氧或缺氧條件下，與對照組相比，5μmol/L組及50μmol/L組的乳酸生成均表現(xiàn)出逐漸下降趨勢，其中在50μmol/L處理組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在對照組，缺氧條件下乳酸的生成明顯多于常氧，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.375，P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of different β-PGG concentrations on lactate production in MiaPaCa-2 cells表2 不同濃度β-PGG對MiaPaCa-2細胞乳酸生成的影響（±s）

Tab.2 Effects of different β-PGG concentrations on lactate production in MiaPaCa-2 cells表2 不同濃度β-PGG對MiaPaCa-2細胞乳酸生成的影響（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與5 μmol/L組比較，P＜0.05

組別對照組5μmol/L 50μmol/L F常氧（n=8）5.91±0.89 5.59±2.26 2.81±1.52ab 8.54＊＊缺氧(n=4)25.11±1.53 22.86±2.23 18.66±2.90a 8.177＊＊

2.3 β-PGG對MiaPaCa-2胰腺癌細胞HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK表達的影響 Western blot結果顯示，β-PGG能抑制HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ、PFK的蛋白表達，且隨著β-PGG濃度越高，抑制效果越明顯（P＜0.05），見圖1，表3。

Fig.1 Expressions of HIF-1α,GLUT1,HK-Ⅱand PFK detected by Western blot assay圖1 Western bolt檢測HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK蛋白的表達

Tab.3 Effects of different β-PGG concentrations on HIF-1α,GLUT1,HK-Ⅱand PFK expressions in MiaPaCa-2 cells表3 不同濃度β-PGG對MiaPaCa-2細胞HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK表達的影響 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of different β-PGG concentrations on HIF-1α,GLUT1,HK-Ⅱand PFK expressions in MiaPaCa-2 cells表3 不同濃度β-PGG對MiaPaCa-2細胞HIF-1α、GLUT1、HK-Ⅱ和PFK表達的影響 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與5μmol/L組比較，c與13μmol/L組比較，d與25μmol/L組比較，e與50μmol/L組比較，P＜0.05

組別HIF-1αGLUT1HK-ⅡPFK對照組5μmol/L 13μmol/L 25μmol/L 50μmol/L 100μmol/L F 1.16±0.21 0.99±0.02 0.86±0.14a 0.75±0.12ab 0.59±0.22abc 0.42±0.13abcd 9.011＊＊1.03±0.14 1.06±0.12 1.09±0.04 1.01±0.02 0.81±0.03abcd 0.67±0.19abcd 7.256＊＊1.02±0.14 1.09±0.01 1.05±0.06 0.79±0.14abc 0.76±0.19abc 0.46±0.18abcde 9.585＊＊1.29±0.13 1.25±0.05 1.00±0.11ab 0.85±0.06abc 0.61±0.08abcd 0.33±0.14abcde 40.31＊＊

3 討論

β-PGG是從中藥中提取的小分子化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗血管生成、抗增殖、降血糖、誘導細胞凋亡、抑制DNA的復制合成、引起細胞周期S期和G1期阻滯等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，β-PGG在前列腺癌、白血病、乳腺癌、肺癌、口腔癌等多種細胞實驗中表現(xiàn)出良好的誘導細胞凋亡、抑制癌細胞增殖和抑制腫瘤血管生成等作用［10-11］。

已有研究發(fā)現(xiàn)，β-PGG可以抑制人乳腺導管癌細胞系T-47D和BT-474的增殖［12］。本研究結果顯示，隨著β-PGG濃度的增加和時間的延長，MiaPaCa-2細胞的增殖活性明顯降低，在100μmol/L的濃度處理72 h，其抑制率高達（82.97±0.78）%，表明β-PGG可以抑制MiaPaCa-2細胞的增殖。經(jīng)5μmol/L和50μmol/L的β-PGG處理后，MiaPaCa-2胰腺癌細胞上清液的乳酸含量均較對照組減少，表明β-PGG能抑制乳酸的生成。

Park等［13］發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細胞系LNCaP中，β-PGG可以抑制HIF-1α的積累、轉(zhuǎn)錄激活及mRNA的表達，通過抑制血管生成，從而抑制腫瘤細胞的活性。包括胰腺癌細胞在內(nèi)的許多癌細胞能表達HIF-1α，繼而表達HIF-1［14-15］，癌細胞表達HIF-1主要是由于兩個原因，一是腫瘤細胞中癌基因的表達加快了HIF-1α的生成，二是腫瘤內(nèi)的缺氧環(huán)境抑制了HIF-1α的降解。HIF-1α的表達使HIF-1靶基因的轉(zhuǎn)錄加快，進而從以下幾個方面影響了癌細胞的生存能力［16］：（1）大量表達糖酵解酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1，將糖酵解（即瓦博格效應）維持在高水平。（2）抗凋亡能力和增殖能力增強。（3）癌細胞侵襲性增強。（4）癌細胞血管生成能力增強。若能干預胰腺癌的缺氧應答，抑制缺氧相關的靶分子，即可以延緩或阻止胰腺癌的進展。因此，HIF-1α對腫瘤的瓦博格效應具有調(diào)控作用。HK-Ⅱ、PFK以及GLUT1是HIF-1α的靶基因，均受HIF-1α的調(diào)控，癌細胞在表達HIF-1α后糖酵解能力會全面加強。因此，抑制了癌細胞的HIF-1α，就能降低該細胞的糖酵解率。本研究主要檢測了β-PGG在缺氧條件下處理胰腺癌細胞后GLUT1、糖酵解關鍵酶HK-Ⅱ和PFK-1的表達，結果顯示β-PGG抑制HIF-1α表達后，這些靶蛋白的表達均下降，即抑制了HIF-1α后，癌細胞的瓦博格效應得到抑制。

綜上所述，β-PGG能抑制人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2的生長及乳酸的生成，其抑制作用是通過抑制HIF-1α和GLUT1以及糖酵解途徑的關鍵酶HK-Ⅱ和PFK的表達實現(xiàn)的。β-PGG可以作為一種預防和治療癌癥的新型候選藥物。