王敏敏，魏建宏，任來峰

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要風(fēng)險(xiǎn)因素［1］，而HCC是最為難治的惡性腫瘤之一，也是我國位居第二的癌癥“殺手”，HCV感染約與20%的HCC相關(guān)［2］。HCV核心蛋白（Core蛋白）除了參與病毒組裝外，還能與正常細(xì)胞蛋白相互作用，擾亂細(xì)胞正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等信號(hào)傳遞［3］。HCV Core蛋白被認(rèn)為是HCV相關(guān)HCC的潛在癌基因或輔因子［4-5］，有研究表明，過表達(dá)HCV Core后，在其轉(zhuǎn)基因（TG）小鼠中可以誘導(dǎo)肝癌的形成［6］。

自噬是一種利用溶酶體將自身細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白以及細(xì)胞器消化降解的過程，并參與細(xì)胞多種生理及病理過程調(diào)控［7］，細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，HCV Core蛋白可誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬［8-9］］，而 Hara等［10］研究顯示，HCV Core蛋白可抑制HCV感染時(shí)的有絲分裂；有研究認(rèn)為，這種抑制可導(dǎo)致線粒體泛素化、有絲分裂體形成和自噬降解的失敗［11］。有關(guān)HCV Core蛋白與自噬的關(guān)系研究尚不多，其具體機(jī)制仍有待闡明。因此，本研究擬通過在HeLa細(xì)胞中表達(dá)外源HCV Core蛋白，研究其對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響，為進(jìn)一步闡明HCV相關(guān)的HCC的發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 主要材料 PLVX-IRES-ZsGreen1過表達(dá)質(zhì)粒和HCV復(fù)制子質(zhì)粒（pJFH1）為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自索萊寶生物技術(shù)公司，人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購自豐暉生物技術(shù)公司，In-Fusion?HD Cloning Kit購自Clontech公司，凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒均購自O(shè)mega公司。限制性內(nèi)切酶XhoⅠ購自北京百奧萊博科技有限公司，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成及DNA測(cè)序；DNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，核染料DAPI購自Vector公司，抗HCV Core抗體購自博奧森公司，實(shí)驗(yàn)所用FITC標(biāo)記的二抗（抗鼠）和內(nèi)參α-tubμlin抗體以及Cyc3標(biāo)記的二抗（抗兔）均購自Sigma公司，抗LC3B抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建 （1）目的基因擴(kuò)增：按照同源重組原理設(shè)計(jì)Core基因引物，上游5′-CGGTGAATTCCTCGAATGAGCACAAATCCTAAACC-3′，下游 5′-TAGAACTAGTCTCGATCAAGCAGAGACCGGAACGGT-3′。以 pJFH1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：上、下游引物各1μL，pJFH1模板0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，dNTP混合液0.5μL，PCR Buffer 2.5μL，ddH2O 19μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min充分延伸。PCR產(chǎn)物分離并純化，4℃保存?zhèn)溆谩＃?）重組載體克隆：XhoⅠ限制性內(nèi)切酶切割空載體PLVX-IRES-ZsGreen1使之線性化，并用凝膠回收試劑盒回收純化；用IN-fusion cloning kit將

HCV Core基因片段與線性化載體進(jìn)行重組；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含氨芐青霉素（Amp）LB培養(yǎng)平板，于37℃培養(yǎng)12 h；挑取LB轉(zhuǎn)化板上的陽性菌落，接種于15 mL（含Amp）LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)18 h（180 r/min）。次日按說明書提取質(zhì)粒，選用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒PLVXIRES-ZsGreen1-Core，并送博奧公司測(cè)序證實(shí)。

1.2.2 細(xì)胞的傳代與培養(yǎng) 用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞，每隔1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞長至匯合度達(dá)85%～90%時(shí)，用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種于無菌24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁生長至約50%～60%匯合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，設(shè)PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、PLVX-IRES-ZsGreen1空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對(duì)照組，采用Lipofectamine 2000按試劑說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染完成6～8 h后換常規(guī)DMEM高糖培養(yǎng)基并于48～72 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)Core蛋白以及LC3蛋白的表達(dá) 參照文獻(xiàn)［12］：轉(zhuǎn)染48 h后，棄去24孔板中的培養(yǎng)基并用預(yù)冷的PBS清洗1次，經(jīng)RIPA裂解液裂解后收集各組細(xì)胞并抽提細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量并調(diào)整蛋白濃度，按說明書加入5×loading buffer煮沸后得到蛋白樣品?？偟鞍捉?jīng)12%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h（搖床），分別用抗HCV Core（1∶100）、LC3B（1∶1 000）、α-tubμlin（1∶5 000）抗體4 ℃孵育過夜，TBST漂洗；再用HRP標(biāo)記的抗兔和抗鼠二抗（1∶2 000）37℃孵育1 h，TBST漂洗，將膜用ECL顯色，F(xiàn)luor Chem FC2成像儀曝光并分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 免疫熒光（IF）檢測(cè)LC3水平 參照文獻(xiàn)［13］：HeLa細(xì)胞接種到24孔板中的細(xì)胞爬片上并轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒48 h后直接收樣；PBS洗滌1次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS漂洗后；用0.3%Triton X-100室溫通透10 min，PBS漂洗；用免疫熒光封閉液（0.1%Triton X-100+1%BSA）室溫封閉30 min以上，加入抗LC3B或抗Core抗體37℃濕盒中孵育30 min，用PBS洗3次；37℃濕盒中孵育熒光素標(biāo)記的抗兔或抗鼠二抗30 min，PBS洗3次；DAPI封片，熒光顯微鏡拍片記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 重組載體用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切結(jié)果顯示，酶切后的重組質(zhì)粒為2個(gè)條帶，大小分別與空載體PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因Core近似，見圖1A。測(cè)序結(jié)果示，與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，重組質(zhì)粒PLVX-IRES-ZsGreen1-Core序列完全正確，見圖1B。

Fig.1 Core-Green digested with EcoRⅠand BamHⅠ圖1 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒的鑒定

2.2 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中的表達(dá) 只有PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞可表達(dá)HCV Core蛋白，而PLVX-IRES-ZsGreen1空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)?？瞻讓?duì)照組的無蛋白表達(dá)，且與Core蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量符合，見圖2。

Fig.2 Expression of HCV Core protein in HeLa cells圖2 HCV Core蛋白在Hela細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬 LVX-IRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞LC3Ⅱ水平（1.069±0.049）高于PLVX-IRES-ZsGreen1空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組（0.776±0.047），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.433，P＜0.05），見圖3。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Western Blot結(jié)果一致，HCV Core蛋白高表達(dá)的細(xì)胞（綠色熒光）LC3焦點(diǎn)明顯增多，且主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，見圖4。

Fig.3 Expression of LC3 detected by Western Blot assay圖3 Western Blot法檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)

3 討論

基因克隆是分子生物學(xué)的基本技術(shù)，與傳統(tǒng)的基于雙酶切的分子克隆技術(shù)比較，近年來發(fā)展起來的基于同源重組的分子克隆技術(shù)（又稱為無縫克隆），具有簡便、快速、高效和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)［14］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用同源重組克隆方法構(gòu)建了PLVX-IRESZsGreen1-Core真核表達(dá)載體，并經(jīng)雙酶切和基因測(cè)序證實(shí)，重組DNA序列正確，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞后可表達(dá)HCV Core蛋白，這些結(jié)果證實(shí)已成功構(gòu)建了HCV Core真核表達(dá)載體。

Fig.4 The changes of LC3 punctuates induced by HCV Core（×1 000）圖4 HCV Core蛋白誘導(dǎo)的LC3焦點(diǎn)變化（×1 000）

研究表明，HCV Core蛋白是誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的最重要蛋白之一［15］，可通過干擾宿主細(xì)胞多條信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化［16］，但其具體致癌細(xì)節(jié)仍需進(jìn)一步研究。自噬是細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化的一種生理病理過程，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體為特征，也是吞噬降解細(xì)胞內(nèi)部分受損細(xì)胞器或變性蛋白的過程［17］。在自噬發(fā)生時(shí)，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein1 light chain3，LC3）定位于前自噬體和自噬體表面，參與自噬體的整個(gè)形成過程，LC3有Ⅰ型和Ⅱ型，自噬發(fā)生時(shí)伴隨著LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化，因此，該轉(zhuǎn)化過程成為評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬的重要參考［18-19］。自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Liu等［20］研究表明，HCV Core蛋白可誘導(dǎo)肝QSG-7701細(xì)胞自噬，并伴隨著LC3Ⅱ升高；Wang等［21］在肝癌細(xì)胞Huh7中的研究表明，HCV Core蛋白通過EIF2AK3和ATF6促進(jìn)細(xì)胞自噬；而Hara等［10］研究則顯示，HCV Core蛋白可抑制細(xì)胞線粒體自噬。本研究中，Western Blot結(jié)果顯示，PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組自噬標(biāo)記分子LC3Ⅱ表達(dá)增加，免疫熒光結(jié)果顯示LC3Ⅱ熒光焦點(diǎn)增多，證實(shí)HCV Core蛋白可提高HeLa細(xì)胞自噬水平。另有研究表明，HCV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬對(duì)病毒自身的復(fù)制至關(guān)重要［22］，同時(shí)細(xì)胞自噬信號(hào)的擾亂勢(shì)必干擾細(xì)胞正常生理過程，可能是其引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的促進(jìn)因素，但具體細(xì)節(jié)仍待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究用無縫克隆方法構(gòu)建PLVXIRES-ZsGreen1-Core重組質(zhì)粒，并可在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，為進(jìn)一步探索HCV Core蛋白干擾宿主細(xì)胞功能奠定了一定的基礎(chǔ)。