加秋萍，梁婉琪，李芬霞，張美，趙宗霞

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710032)

卵巢癌是女性常見的生殖器官惡性腫瘤之一。卵巢癌的發(fā)病率及死亡率均位于我國女性生殖器官惡性腫瘤的前五名[1-2]。卵巢癌惡性程度高，極易在盆腹腔擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，5年生存率低于50%[3-4]。Yin Yang 1(YY1)是一個(gè)參與了多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的癌基因[5]。人源YY1由414個(gè)氨基酸組成，是屬于一種鋅指蛋白類同時(shí)具有復(fù)雜功能的轉(zhuǎn)錄因子，YY1可將組蛋白脫乙酰酶和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶直接導(dǎo)入啟動(dòng)子以激活或抑制啟動(dòng)子，可以同時(shí)促進(jìn)和抑制相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄。國內(nèi)外研究表明YY1在具有轉(zhuǎn)移和侵襲性的腫瘤如前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌中高表達(dá)[6]，其過量表達(dá)與腫瘤的臨床病理分期和轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是早期腫瘤轉(zhuǎn)化為具有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性的主要機(jī)制，主要由于上皮特性的喪失和間質(zhì)特性的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)了腫瘤的侵襲性[7]。研究表明，在胃癌中EMT的發(fā)生可以促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[8]，越來越多的研究將YY1和EMT之間的相互作用作為重要研究方向。本研究采用卵巢癌患者腫瘤組織和卵巢癌細(xì)胞系HO8910PM，探討YY1是否通過促進(jìn)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)從而對卵巢癌形成轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。

材料和方法

一、研究對象

本研究共納入本院2017年10月至2018年5月收治的85例卵巢癌患者，年齡29～63歲，平均(49.35±6.63)歲；依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅲ期68例，Ⅳ期17例；病理分型：上皮型惡性腫瘤63例(黏液型6例，漿液型48例，透明細(xì)胞腫瘤4例，子宮內(nèi)膜樣腫瘤3例，移行細(xì)胞腫瘤2例)，非上皮型惡性腫瘤22例。所有卵巢癌患者均經(jīng)過病理檢驗(yàn)科診斷證實(shí)，所有患者取材時(shí)尚未經(jīng)過任何治療。實(shí)驗(yàn)方法和目的均告知患者和家屬，并簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.主要試劑和儀器：卵巢癌細(xì)胞系HO8910PM(中科院上海細(xì)胞庫)；胎牛血清(Gibcom，美國)，RPMI 1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶(Thermo Fisher，美國)；Trans-well小室(Costar，美國)；Matrigel生物膠(BD，美國)；YY1引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen，美國)；Hoechst 染料(Sigma，美國)；4%多聚甲醛(北京鼎國昌盛生物技術(shù))；結(jié)晶紫(西安國安生物科技)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：卵巢癌細(xì)胞系HO8910PM采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用0.25%的胰蛋白酶消化指數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔接種的細(xì)胞數(shù)約5×105個(gè)，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000 Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書上的實(shí)驗(yàn)步驟，將50 pmol的YY1小干擾RNA(small interfere RNA，siRNA)和50 pmol的YY1陰性對照(negative control，NC)轉(zhuǎn)染到HO8910PM細(xì)胞中，4～6 h后更換培養(yǎng)液，48 h后提取RNA，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中YY1的表達(dá)變化，并收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)：提取總RNA，定量后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR檢測YY1的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△CT法進(jìn)行相對定量分析。qRT-PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。YY1引物序列(5’-3’)：正向TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT；反向GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT。

5.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞按1×104/孔的密度接種于96孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入20 μl的CCK-8，再在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，室溫條件下于搖床震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長測OD 值。

6.Trans-well細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：配制BD膠和培養(yǎng)液(1：9)，冰上操作，然后在 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育5 h，在 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱水化基底膜 30 min。胰蛋白酶消化指數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，無血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104/孔，Trans-well 小室下室加入正常10% 胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液600 μl，接種200 μl無血清細(xì)胞懸液于24孔 Trans-well小室上室，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。16 h后PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，室溫風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗3遍，用棉簽輕輕擦去上層未遷移的細(xì)胞，33%乙酸脫色，570 nm讀數(shù)。

7.Western blot：將濃度1×106/ml的細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁取出6孔板，棄掉上清；PBS清洗1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液并吹打細(xì)胞團(tuán)，后放置冰上裂解，30 min后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來轉(zhuǎn)移至1.5 ml試管中，高速離心并抽取上清，即為所提蛋白。取患者腫瘤組織液氮冷凍，隨后進(jìn)行碾磨，裂解液裂解，低溫離心取上清，即為組織蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min，樣品可凍于-80℃保存。SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜成功后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉，PBS清洗，裁剪條帶并分別加入相應(yīng)抗體，均為1：1 000稀釋，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復(fù)清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復(fù)沖洗，然后加ECL發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光儀檢測并拍照。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、YY1在卵巢癌、癌旁組織和正常組織的表達(dá)

收集卵巢癌患者手術(shù)樣本，采用qRT-PCR和Western Blot分析YY1在癌組織(OCT)、癌旁組織(PT)和正常組織(NT)中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，YY1在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織和正常組織(P<0.01)(圖1)。

A：qRT-PCR檢測YY1 mRNA的表達(dá)；B：Western Blot檢測YY1蛋白的表達(dá)與其他兩組比較，*P<0.01；與NT組比較，#P<0.05圖1 YY1在卵巢癌、癌旁組織和正常組織的表達(dá)

二、干擾RNA瞬轉(zhuǎn)技術(shù)降低YY1在細(xì)胞中的表達(dá)

首先檢測了4種人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV3、OVCAR-3、HO8910PM、A2780)中YY1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YY1在HO8910PM細(xì)胞系表達(dá)最高(圖2A)；其次利用YY1干擾RNA及其對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HO8910PM構(gòu)建YY1低表達(dá)細(xì)胞系(HO8910PM-si)和對照細(xì)胞系(HO8910PM-NC)。qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后YY1在mRNA水平表達(dá)情況(如圖2B)，結(jié)果顯示在卵巢癌細(xì)胞系HO8910PM中轉(zhuǎn)染干擾RNA后，YY1的表達(dá)水平下調(diào)，具有顯著性差異(P<0.05)。

三、 YY1下調(diào)后對HO8910PM細(xì)胞增殖作用影響

CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，降低卵巢癌細(xì)胞YY1表達(dá)，干擾組的增殖細(xì)胞數(shù)顯著低于NC組，說明降低YY1的表達(dá)可以顯著抑制卵巢癌HO8910PM的增殖能力(P<0.01)(圖3)。

A：4種卵巢癌細(xì)胞中YY 1蛋白表達(dá)；B：YY1干擾RNA瞬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染后HO8910PM細(xì)胞中YY 1 mRNA表達(dá)與其他組比較，*P<0.05圖2 YY1在不同腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)情況

相互比較，*P<0.05，#P<0.01圖3 YY1表達(dá)下調(diào)對HO8910PM細(xì)胞增殖能力的影響

四、YY1下調(diào)對HO8910PM細(xì)胞侵襲能力的影響

Trans-well侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YY1干擾組的細(xì)胞侵襲能力顯著低于NC組，說明降低YY1的表達(dá)可以顯著抑制卵巢癌HO8910PM細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)(圖4)。

五、YY1下調(diào)后對HO8910PM細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，YY1干擾HO8910PM細(xì)胞與NC組相比，E-cadherin表達(dá)增高而N-cadherin和Vimentin表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖5)。

相互比較，*P<0.01圖4 YY1表達(dá)下調(diào)對HO8910PM細(xì)胞侵襲能力的影響

相互比較，*P<0.05圖5 YY1表達(dá)下調(diào)對HO8910PM細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響

討 論

卵巢癌已經(jīng)成為世界上發(fā)病率及死亡率僅次于宮頸癌的女性生殖器官惡性腫瘤，其惡性程度高，轉(zhuǎn)移率高，臨床治療效果極差，5年生存率遠(yuǎn)低于其它腫瘤。因此，發(fā)現(xiàn)新的靶分子可以為提高卵巢癌治療及預(yù)后提供更好的研究方向。EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，越來越多的研究將EMT作為卵巢癌轉(zhuǎn)移的重要研究方向。E-cadherin和Vimentin作為EMT的關(guān)鍵分子可能受多種機(jī)制調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄因子、mirRNA等[7-8]。因此針對EMT的深入研究，對于揭示卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和腫瘤的治療具有重要意義。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)YY1可以參與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移調(diào)控[9-11]。YY1既可以通過靶向lncRNAPVT1調(diào)節(jié)肺癌的惡性病變[12-15]，也可以通過與RING1的相互作用抑制乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[16-17]。Khachigian[18]則提出YY1可以作為腫瘤治療的一個(gè)新興靶點(diǎn)。以上結(jié)果均提示YY1在腫瘤的形成、發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的增殖中可能發(fā)揮重要作用，可能作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究為了驗(yàn)證YY1在卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用，首先通過查閱數(shù)據(jù)庫分析YY1在多種惡性腫瘤中表達(dá)趨勢，結(jié)果顯示YY1在多種具有高轉(zhuǎn)移性的腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌等高表達(dá)。通過qRT-PCR和Western Blot檢測85例卵巢癌患者腫瘤組織與癌旁正常組織中YY1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)YY1在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。為了進(jìn)一步分析YY1在卵巢癌中的作用，采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)YY1在卵巢癌細(xì)胞系HO8910PM中的表達(dá)，qRT-PCR檢測干擾前后細(xì)胞系YY1的表達(dá)，結(jié)果表明YY1在mRNA水平表達(dá)被顯著降低，說明成功利用siRNA構(gòu)建了YY1敲減細(xì)胞系。通過增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證下調(diào)YY1表達(dá)后的卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞系增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力顯著下調(diào)。同時(shí)通過驗(yàn)證YY1與EMT相關(guān)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)YY1可以通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白N-cadherin和Vimentin表達(dá)、抑制E-cadherin的表達(dá)來激活卵巢癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。

通過研究結(jié)果，本研究認(rèn)為YY1與卵巢癌轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，YY1可能在卵巢癌進(jìn)展中具有調(diào)節(jié)EMT的重要作用，有望成為卵巢癌的治療靶點(diǎn)。在臨床上，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)論有望為YY1靶向基因治療卵巢癌提供部分依據(jù)。