賀桑，劉佶，彭婀娜，譚小軍，何方，毛卓，許鵬，黃向紅

(湖南湘潭市中心醫(yī)院，湘潭 411000)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)指女性青春期發(fā)育后，于40歲前出現(xiàn)閉經(jīng)、卵巢體積縮小、體內(nèi)雌激素水平下降、促性腺激素水平達(dá)到絕經(jīng)后水平的現(xiàn)象。引起該病的病因很多，包括遺傳、環(huán)境、手術(shù)、接觸有害物質(zhì)等[1]，在婦產(chǎn)科中屬于較為常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病[2]，其中約80%患者病因不明[3-5]，稱(chēng)為特發(fā)性卵巢早衰。卵巢早衰患者早期可表現(xiàn)為月經(jīng)不規(guī)律或月經(jīng)稀發(fā)，繼而發(fā)生持續(xù)性閉經(jīng)[6]，其發(fā)病近年來(lái)有年輕化趨勢(shì)[7]。我們針對(duì)一對(duì)同時(shí)患有卵巢早衰的親生姐妹的病例資料進(jìn)行研究分析，旨在探究該家系特發(fā)性卵巢早衰的致病原因。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象：本次調(diào)查由湘潭市中心醫(yī)院生殖與遺傳中心于2009～2011年完成。該家系的分子遺傳學(xué)研究得到湘潭市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的論證認(rèn)可和全體家系成員的知情同意?；颊邚堺惡蛷埼?均為化名)為非孿生親生姐妹。其父母為近親婚配，為姑表親(張麗、張文的爺爺與外婆為親兄妹)，共生育2女1子，女性后代均診斷卵巢早衰(圖1)；其子23歲，尚未結(jié)婚。

對(duì)家系中患者及父母雙親進(jìn)行病史采集和全身體格檢查，并抽取外周靜脈血5～10 ml，提取DNA，-20 ℃保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 卵巢早衰患者家系圖譜

2.全外顯子測(cè)序分析：全外顯子測(cè)序由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行，應(yīng)用NimbleGen SeqCap EZ Exome(44 M)捕獲平臺(tái)進(jìn)行外顯子捕獲測(cè)序，獲得的DNA片段用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)序，每個(gè)樣本的有效平均測(cè)序深度達(dá)到×50。4份樣本測(cè)序結(jié)果覆蓋了幾乎所有外顯子，測(cè)序數(shù)據(jù)量18 698 Mb，有效評(píng)價(jià)覆蓋深度平均值為61.54，目標(biāo)區(qū)域覆蓋大于4×的比例為97.8%。

3.基因分析、Sanger測(cè)序驗(yàn)證及致病性分析：后期經(jīng)過(guò)排除內(nèi)含子突變、非移碼突變或缺失以及基因互作分析，并經(jīng)Sanger測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證[8]；篩選出可能致病位點(diǎn)；根據(jù)生物信息軟件(SIFT、Polyphen2、Condel)對(duì)可能致病位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析。

二、結(jié)果

1.卵巢早衰姐妹臨床資料：(1)妹妹，31歲，身高167 cm，體重60 kg，因“反復(fù)閉經(jīng)12年”于2009年5月湘潭市中心醫(yī)院生殖與遺傳中心就診。查性激素：卵泡刺激素 79.2 U/L、黃體生成素 67.3 U/L、雌二醇 44.04 pmol/L；婦科彩超提示：子宮未見(jiàn)異常，雙側(cè)卵巢體積小，雙側(cè)竇卵泡數(shù)(AFC)實(shí)性；體查：乳房發(fā)育正常，外陰女型，陰毛稀疏，色淺，子宮前位，大小質(zhì)地活動(dòng)正常，雙側(cè)附件未捫及異常。染色體核型分析：46，XX(圖2A)。(2)姐姐，34歲，身高157 cm，體重48 kg，因“婚后11年，月經(jīng)紊亂10年，閉經(jīng)8年”于2010年6月湘潭市中心醫(yī)院生殖與遺傳中心就診。查性激素：卵泡刺激素 102.6 U/L、黃體生成素 121.5 U/L、雌二醇 47.71 pmol/L；婦科彩超提示：子宮未見(jiàn)異常，雙側(cè)卵巢體積小，雙側(cè)AFC實(shí)性；體查：乳房偏小，外陰女型，陰毛稀疏，顏色正常，子宮前位，大小質(zhì)地活動(dòng)正常，雙側(cè)附件未捫及異常。染色體核型分析：46，XX，16qh+(圖2B)。

A：妹妹核型；B：姐姐核型(箭頭示16qh+)圖2 卵巢早衰姐妹染色體核型分析

2.全外顯子測(cè)序分析：由于家系成員過(guò)少，無(wú)法預(yù)先判斷疾病的遺傳方式，因此全外顯子測(cè)序之后，我們采取假設(shè)驗(yàn)證的方式分析。由于患者父母并未發(fā)病，可排除常染色體顯性遺傳、X連鎖顯性遺傳和Y染色體遺傳的可能。根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律，該家系可能有2種遺傳方式：常染色體隱性遺傳病和X連鎖隱性遺傳病。經(jīng)過(guò)生物信息分析，利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)(千人基因、ESP 數(shù)據(jù)庫(kù))對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。在假設(shè)X連鎖隱性遺傳的情況下，沒(méi)有篩選到符合條件的 SNV 位點(diǎn)，所以最終確定遺傳方式為常染色體隱性遺傳。經(jīng)過(guò)全外顯子測(cè)序后，初步篩選得到12個(gè)突變基因(16個(gè)位點(diǎn))(表1)。

3.基因分析及sanger測(cè)序驗(yàn)證：后期經(jīng)過(guò)排除內(nèi)含子突變、非移碼突變或缺失以及基因互作分析，并經(jīng)sanger測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，最后篩選出2個(gè)可能致病位點(diǎn)：分別位于基因 AHDC1和PTPN14上。結(jié)合Sanger測(cè)序方法對(duì)家系內(nèi)成員進(jìn)行共分離驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)基因 AHDC1 c.C874T和PTPN14 c.G3344A與表型共分離。

4.致病性分析：根據(jù)生物信息軟件(SIFT、Polyphen2、Condel)對(duì)AHDC1和PTPN14基因突變位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析。SIFT軟件分析發(fā)現(xiàn)ADHC1 c.C874T和PTPN14 c.G3344A的值為0.01和0.02(<0.05說(shuō)明有害突變)。PolyPhen2和Condel軟件分析值越高，表示致病性可能較大，而這兩個(gè)突變位點(diǎn)分析值都接近1(表2)。

三、討論

本研究中，兩位姐妹因父母為姑表親近親結(jié)婚，通過(guò)外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)基因AHDC1(AT hook DNA binding containing 1，AT鉤DNA結(jié)合蛋白1)和PTPN14(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type14，蛋白酪氨酸磷酸酶14)可能為兩位姐妹發(fā)生卵巢早衰的致病基因。由此推測(cè)，其父母雙親可能攜帶其中一個(gè)致病基因，由于只攜帶一個(gè)致病基因，所以并沒(méi)有導(dǎo)致疾病的發(fā)生，故父母雙親均無(wú)致病的表現(xiàn)。而近親婚配時(shí)，各自攜帶的單獨(dú)的致病基因均遺傳給子代，使子代致病。

表1 初篩12個(gè)突變基因(16個(gè)位點(diǎn))

表2 SIFT、Polyphen2、Condel軟件預(yù)測(cè)致病性結(jié)果

既往文獻(xiàn)報(bào)道，基因AHDC1與食管癌的發(fā)生有關(guān)，含有AT鉤DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白可以影響染色體的結(jié)構(gòu)并可調(diào)控AT富含區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄[9-10]。此外，其他文獻(xiàn)報(bào)道，AHDC1基因新發(fā)剪切突變導(dǎo)致蛋白編碼提前終止，致使患者出現(xiàn)精神、運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言發(fā)育緩慢，肌張力低下，腦發(fā)育不良等[11]。PTPN14是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶超家族的成員，與多種細(xì)胞過(guò)程密切相關(guān)，比如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、腫瘤發(fā)生等過(guò)程，文獻(xiàn)報(bào)道與乳腺癌、食管癌、膽管癌的發(fā)病有關(guān)。這兩個(gè)基因都是多細(xì)胞、多信號(hào)通路調(diào)控的相關(guān)基因，目前雖然尚無(wú)研究證實(shí)AHDC1和PTPN14與卵巢相關(guān)疾病有關(guān)，但是由于卵巢早衰本身機(jī)制復(fù)雜，是否AHDC1和PTPN14在某個(gè)信號(hào)通路調(diào)控過(guò)程中發(fā)生了改變并最終導(dǎo)致卵巢早衰，還需要進(jìn)一步的深入研究。同時(shí)，也不能排除遺傳過(guò)程中新發(fā)突變導(dǎo)致的疾病。

本研究通過(guò)全外顯子測(cè)序分析該家系成員4名，發(fā)現(xiàn)基因AHDC1和PTPN14可能為該家系特發(fā)性卵巢早衰的致病基因。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道基因 AHDC1 和PTPN14是否與卵巢早衰發(fā)病相關(guān)，并且上述實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)單個(gè)家系進(jìn)行基因測(cè)序。我中心將繼續(xù)通過(guò)擴(kuò)大樣本，同時(shí)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及基因敲除技術(shù)來(lái)進(jìn)一步研究卵巢早衰與上述基因的相關(guān)性，以期為特發(fā)性卵巢早衰提供新的研究靶點(diǎn)。