陳艷婷，王玉林，袁秋虹，鄧偉民，郭新宇 *

(1.中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，廣州 510010；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院內(nèi)三科，佛山 528333)

隨著IVF-ET的發(fā)展，促排卵技術(shù)作為IVF-ET的關(guān)鍵環(huán)節(jié)也趨向多樣化、個(gè)體化發(fā)展。促排卵技術(shù)主要是在外源性的人為激素的干預(yù)下，通過(guò)增強(qiáng)或改善卵巢自身的內(nèi)分泌及排卵功能，以獲取多個(gè)卵母細(xì)胞，為提高IVF-ET的成功率創(chuàng)造機(jī)會(huì)。但促排卵過(guò)程中，非生理劑量促性腺激素的運(yùn)用，最終導(dǎo)致體內(nèi)的雌激素超出生理水平[1]，高于生理水平的雌激素是否影響卵泡及胚胎質(zhì)量還未得出一致結(jié)論[2]。卵泡是卵巢的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，在卵泡發(fā)育成熟過(guò)程中，顆粒細(xì)胞的增殖、分化對(duì)卵泡的發(fā)育有著重要的作用。顆粒細(xì)胞的凋亡可抑制卵母細(xì)胞及卵泡的發(fā)育，促進(jìn)卵泡閉鎖。因此，本研究模擬臨床不同促排卵方案建立小鼠模型，通過(guò)觀察不同促排卵方案對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，以探討不同促排卵方案對(duì)卵泡質(zhì)量的影響。

材料與方法

一、藥物、試劑與儀器

醋酸曲普瑞林注射液(GnRH-a，輝凌，瑞士)；注射用醋酸西曲瑞克(GnRH-ant，Pierre Fabre，法國(guó))；注射用血促性素(PMSG，Prospecbio，以色列)；人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠醫(yī)藥)。兔抗小鼠Fas抗體(ab82419，Abcam，英國(guó))，兔抗小鼠FasL抗體(af0157，Affnity Biosciences，美國(guó))，兔抗小鼠Caspase-8抗體(ab25901，Abcam，英國(guó))，兔抗小鼠Caspase-3抗體(bs-0081R，北京博奧森)，山羊抗兔鼠通用二抗(GK500705，上海基因，)，包埋機(jī)(JB-P5，武漢俊杰電子)，病理切片機(jī)(RM2016，上海徠卡儀器)，倒置熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE TI-SR，尼康，日本)。

二、研究方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：SPF級(jí)KM雌性小鼠40只，6～8周齡，體重20～25 g(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：44007200046941)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，隨機(jī)分為4組：孕馬血清促排卵組(PMSG組)、促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑組(GnRH-a組)、促性腺激素釋放激素拮抗劑組(GnRH-ant組)、自然排卵組(空白對(duì)照組)，每組10只。

2.各組小鼠具體促排卵方案及操作如下[3-4]：GnRH-a組：小鼠于陰道涂片為動(dòng)情后期(動(dòng)情周期第3天)時(shí)，每日9：00 am 腹腔注射醋酸曲普瑞林20 μg/kg，連續(xù)9 d，第9天同時(shí)腹腔注射PMSG 400 U/kg，48 h 后腹腔注射HCG 1 000 U/kg；GnRH-ant組：GnRH-ant組小鼠以醋酸西曲瑞克注射液400 U/kg代替GnRH-a腹腔注射，其余處理同GnRH-a組；PMSG組：PMSG組小鼠以等體積生理鹽水代替GnRH-a腹腔注射，其余處理同GnRH-a組。空白對(duì)照組：空白對(duì)照組小鼠每日給予等體積生理鹽水腹腔注射，連續(xù)11 d。

各組小鼠于最后一次腹腔注射2 h后頸椎脫臼處死，快速取出雙側(cè)卵巢，其中一側(cè)卵巢經(jīng)4%多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)；另一側(cè)卵巢置于-80℃冰箱凍存。

3.檢測(cè)指標(biāo)與方法：免疫組化檢測(cè)各組小鼠卵巢組織中Fas、FasL、Caspase8、Caspase3的表達(dá)。石蠟切片脫蠟至水，切片浸泡于裝滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加一抗過(guò)夜，加二抗孵育，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間(一般在2 min以內(nèi))，陽(yáng)性為棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，最后脫水封片。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組小鼠卵巢組織中Fas、FasL、Caspase8、Caspase3的蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析，以平均光密度值(IOD)表示結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)越強(qiáng)，IOD值越大。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

各組小鼠經(jīng)不同促排卵方案干預(yù)后，卵巢顆粒細(xì)胞免疫組化Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表達(dá)水平總體趨勢(shì)為：GnRH-a組/GnRH-ant組>空白對(duì)照組>PMSG組。其中，PMSG組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表達(dá)低于空白對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GnRH-a組與GnRH-ant組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)(圖1～4，表1)。

A：PMSG組；B：GnRH-a組；C：GnRH-ant組；D：空白對(duì)照組；箭頭示卵泡圖2 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞FasL的表達(dá)(免疫組織化學(xué),×40)

A：PMSG組；B：GnRH-a組；C：GnRH-ant組；D：空白對(duì)照組；箭頭示卵泡圖3 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase8的表達(dá)(免疫組織化學(xué),×40)

A：PMSG組；B：GnRH-a組；C：GnRH-ant組；D：空白對(duì)照組；箭頭示卵泡圖4 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase3的表達(dá)(免疫組織化學(xué),×40)

組 別例數(shù)FasFasLCaspase8Caspase3PMSG組1034.58±9.9021.24±2.3721.19±1.2320.01±5.19GnRH-a組1070.93±8.26#43.82±4.01#76.47±6.80#49.60±8.04?GnRH-ant組1078.83±8.54#37.35±4.90?78.10±6.06#58.59±9.54#空白對(duì)照組1036.10±2.7824.29±6.2122.28±3.1728.11±2.01

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01

討 論

卵泡發(fā)育是由原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)的，依次發(fā)育為初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡和成熟卵泡。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)啟動(dòng)早于卵母細(xì)胞，提示顆粒細(xì)胞的變化可作為卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)的信號(hào)，也說(shuō)明顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化可能是原始卵泡啟動(dòng)發(fā)育的關(guān)鍵。作為卵巢的主要功能細(xì)胞之一，顆粒細(xì)胞具有支持和營(yíng)養(yǎng)卵母細(xì)胞的作用，在卵泡發(fā)育過(guò)程的不同階段，顆粒細(xì)胞接受來(lái)自生殖軸神經(jīng)內(nèi)分泌和卵巢自分泌、旁分泌的調(diào)控而發(fā)生增殖或凋亡，是影響生殖功能的重要一環(huán)。細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的根本機(jī)制[5-8]，它所累及的主要是顆粒細(xì)胞的凋亡[9]。Wallace等[10]研究認(rèn)為，卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵泡液中代謝產(chǎn)物有關(guān)，而卵泡液中多種細(xì)胞因子及激素的產(chǎn)生主要依賴于顆粒細(xì)胞。如果顆粒細(xì)胞大量凋亡，將引起卵泡內(nèi)局部環(huán)境變化，干擾正常卵泡發(fā)育，導(dǎo)致卵巢病理性改變，并直接影響 IVF-ET 結(jié)局與妊娠成功率。所以顆粒細(xì)胞是一個(gè)較好的評(píng)價(jià)卵巢功能及卵泡質(zhì)量的系統(tǒng)[11]。Fas 通路是經(jīng)典細(xì)胞凋亡通路之一，以Fas系統(tǒng)為代表的死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的重要途徑之一[12-14]，由Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路Fas-FasL-Caspase8-Caspase3的激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不可逆的發(fā)生。

研究表明，GnRH-a方案對(duì)人顆粒細(xì)胞及豬卵巢顆粒細(xì)胞均有直接的促凋亡作用[15-16]。Giampietro等[17]通過(guò)對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能正常的婦女卵巢顆粒細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，GnRH-ant方案可導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡率的上升及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的增加。并且有研究發(fā)現(xiàn)[18]，GnRH-a方案與GnRH-ant方案治療后婦女卵巢顆粒細(xì)胞凋亡水平相當(dāng)，兩種方案對(duì)顆粒細(xì)胞的凋亡率無(wú)明顯差異。本研究中，GnRH-a組和GnRH-ant組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組升高，說(shuō)明GnRH-a方案和GnRH-ant方案促進(jìn)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Fas細(xì)胞凋亡信號(hào)通路各凋亡因子的表達(dá)，促進(jìn)了小鼠顆粒細(xì)胞的凋亡，而GnRH-a組和GnRH-ant組兩組間凋亡水平無(wú)明顯差異，與以上研究結(jié)果基本一致。研究表明，PMSG方案具有抑制卵泡閉鎖以及顆粒細(xì)胞凋亡的作用，可促進(jìn)卵泡重新生長(zhǎng)發(fā)育成熟[19]，增加卵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成能力[20]，提高卵母細(xì)胞體外發(fā)育潛能[21]。本研究中PMSG組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組降低，說(shuō)明PMSG方案可以下調(diào)Fas通路上各凋亡因子的表達(dá)水平，抑制小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，并使其接近自然排卵小鼠狀態(tài)。

總之，不同促排卵方案對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的影響不同，GnRH-a方案和GnRH-ant方案促進(jìn)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Fas細(xì)胞凋亡信號(hào)通路各凋亡因子的表達(dá)，促進(jìn)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡；PMSG方案則下調(diào)Fas通路上各凋亡因子的表達(dá)水平，抑制小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。鑒于顆粒細(xì)胞與卵泡質(zhì)量的密切關(guān)系，推測(cè)GnRH-a方案和GnRH-ant方案對(duì)卵泡發(fā)育有一定程度的不利影響，PMSG方案可在一定程度促進(jìn)卵泡發(fā)育。