鄭 倩，周菊麗，宋冠華，廖建良

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

β-氧化石竹烯屬于倍半萜烯類化合物，它是番石榴葉的揮發(fā)油成分之一［1］，同時(shí)也是青蒿、艾葉、沉香等植物揮發(fā)油中含量較高的一種精油成分，在化妝品和食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用.關(guān)于倍半萜的研究，一直是天然產(chǎn)物化學(xué)成分研究中較為活躍的領(lǐng)域，同時(shí)也是尋找和發(fā)現(xiàn)天然藥物生物活性成分的重要來源［2］.以往的研究證明β-氧化石竹烯具有抗血小板聚集的活性［3］以及鎮(zhèn)痛和抗炎［4］、抗真菌［5］等作用，此外，它的抗癌活性也被發(fā)現(xiàn)，能作為一種有效抗癌藥物在部分腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出細(xì)胞毒性［1，6-8］. 雖然β-氧化石竹烯對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性以及一些分子機(jī)制已有研究報(bào)道，但該藥物對(duì)不同細(xì)胞存在抑制顯著性差異同時(shí)在不同細(xì)胞中抑制增殖的機(jī)制也不同.因此本實(shí)驗(yàn)我們通過對(duì)β-氧化石竹烯在四種腫瘤細(xì)胞增殖中的影響進(jìn)行比較，篩選出了極顯著抑制效果的宮頸癌Hela細(xì)胞，并初步從分子水平進(jìn)行了凋亡研究，為β-氧化石竹烯在宮頸癌治療中的可能作用提供研究基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑

β-氧化石竹烯（98%）和DMSO購自Sigma公司，DMEM高糖液體培養(yǎng)基和無支原體胎牛血清購自Gibco公司，雙抗、MTT、胰酶消化液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所.Annexin-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，β-actin、Bcl-2、Bax和P53抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗購于Takara公司.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A375、Hela、Hep-2和LOVO四種細(xì)胞系由華南師范大學(xué)轉(zhuǎn)贈(zèng).A375和Hela細(xì)胞系的培養(yǎng)基為加1%雙抗和10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，LOVO細(xì)胞系和Hep-2細(xì)胞系的培養(yǎng)基為加1%雙抗和10%FBS的F12K完全培養(yǎng)基.

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖測(cè)定

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的四種腫瘤細(xì)胞分別接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，移去舊培養(yǎng)基，加入含有不同濃度β-氧化石竹烯的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后，每孔加入20 μL 的0.005 mg·L-1MTT溶液，孵育4 h，棄上清，100 μL DMSO加入到每孔中，繼續(xù)37℃暗培養(yǎng)15 min后，570 nm下測(cè)定每孔的OD值.每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)，并以完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照.

2.2 AO/EB熒光染色

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，待貼壁后使用32 μM濃度的β-氧化石竹烯處理48 h，消化并離心收集細(xì)胞，加入95 μL完全培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮，同時(shí)加入5 μL AO/EB混合液，吸取20 μL的細(xì)胞懸液于干凈載玻片上，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察.

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞接種到6孔板中，β-氧化石竹烯處理48 h后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，棄上清，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI，混勻后室溫下避光孵育15 min，盡快進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè).

2.4 蛋白免疫印跡

β-氧化石竹烯處理Hela細(xì)胞48 h后，離心收集并裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線按每孔40 μg蛋白計(jì)算蛋白上樣量.Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況.

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，顯著性由*P＜0.05，**P＜0.01表示.

3 結(jié)果

3.1CPO對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)不同濃度β-氧化石竹烯分別處理四種腫瘤細(xì)胞A375、Hela、Hep-2、LOVO 24 h和48 h后細(xì)胞增殖的變化，圖1A和1B結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，β-氧化石竹烯對(duì)四種腫瘤細(xì)胞都有不同程度的抑制作用，且48 h處理組相比24 h處理組抑制作用更明顯.

圖1 A CPO處理24 h后的細(xì)胞抑制率

圖1 B CPO處理48 h后的細(xì)胞抑制率

表1中的IC50結(jié)果顯示，四種腫瘤細(xì)胞經(jīng)過48 h處理后Hela細(xì)胞對(duì)β-氧化石竹烯最為敏感，IC50為37.08±0.25μM.

表1 CPO處理48 h后的各細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）

3.2 CPO對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

采用倒置光學(xué)顯微鏡對(duì)濃度為32 μM β-氧化石竹烯處理48 h前后Hela細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示經(jīng)過藥物處理的細(xì)胞出現(xiàn)變圓皺縮的形態(tài)變化.AO/EB的染色結(jié)果顯示，未處理的正常細(xì)胞呈現(xiàn)出均勻的綠色熒光，而經(jīng)過藥物處理后的細(xì)胞則出現(xiàn)較明亮的黃綠色或橘紅色熒光，表明細(xì)胞出現(xiàn)了一定程度的凋亡（圖2）.

圖2 β-氧化石竹烯處理Hela細(xì)胞48 h后AO/EB熒光染色結(jié)果

3.3 CPO對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)了經(jīng)過β-氧化石竹烯處理48 h后的細(xì)胞凋亡率變化情況，從圖3可以看到β-氧化石竹烯處理后，隨著處理濃度的上升，細(xì)胞凋亡率也隨之升高，表現(xiàn)藥物濃度依賴性.

圖3 β-氧化石竹烯處理Hela細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率的變化

3.4 CPO對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

Western blot對(duì)與凋亡密切相關(guān)的三種蛋白Bax、Bcl-2和p53的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示經(jīng)過β-氧化石竹烯處理48 h后促凋亡蛋白Bax和p53的表達(dá)水平均隨著藥物處理濃度的升高而上調(diào)；凋亡抑制蛋白Bcl-2則隨著藥物濃度的升高而下調(diào).這一結(jié)果表明β-氧化石竹烯能夠影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平從而引起細(xì)胞出現(xiàn)凋亡反應(yīng)（圖4）.

圖4 β-氧化石竹烯處理Hela細(xì)胞48 h后蛋白表達(dá)的變化

4 討論

目前，尋找新的高效且低毒副作用較小的抗癌新藥是癌癥研究者們的研究熱點(diǎn)［9］.在自然界中部分植物含有廣泛的天然活性成分，且部分成分具有高效低毒、多靶點(diǎn)、特異性強(qiáng)等多重作用，已逐漸獲得了廣大研究者們的青睞［10］.β-氧化石竹烯雖然在一些腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出抗腫瘤活性，但鑒于藥物本身的特異性以及細(xì)胞敏感性差異，本研究選擇β-氧化石竹烯作用于A375、Hela、Hep-2、LOVO四種細(xì)胞，以篩選出抑制效果更好的細(xì)胞種類.MTT法是檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖影響的常用方法.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β-氧化石竹烯對(duì)四種不同細(xì)胞有選擇性抑制效果，可以在48 h處理下顯著抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，這表明β-氧化石竹烯具有作為抗宮頸癌藥物的潛在可能性.

腫瘤細(xì)胞能夠持續(xù)的分裂增殖，因此，通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡來減少癌細(xì)胞過度增殖積累以達(dá)到治療癌癥的目的成為目前抗癌研究的重要方向.而細(xì)胞發(fā)生凋亡往往伴隨著一系列形態(tài)上的變化，比如經(jīng)過AO/EB染色時(shí)，細(xì)胞若發(fā)生早期凋亡會(huì)導(dǎo)致AO透過細(xì)胞嵌入細(xì)胞核DNA發(fā)生較明亮的綠色熒光，其強(qiáng)度高于正常細(xì)胞的染色效果，而在凋亡晚期AO和EB均能進(jìn)入細(xì)胞核嵌入DNA，從而出現(xiàn)黃綠色或橘紅色的熒光［11］.從我們得到的結(jié)果可以看出，相比正常細(xì)胞的染色，β-氧化石竹烯處理的細(xì)胞經(jīng)過AO/EB染色后出現(xiàn)黃綠色或橘紅色的熒光，這說明細(xì)胞經(jīng)過β-氧化石竹烯處理后可能發(fā)生了凋亡反應(yīng).流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明β-氧化石竹烯處理48 h確實(shí)能引起細(xì)胞濃度依賴性的凋亡，與形態(tài)變化結(jié)果一致.在細(xì)胞凋亡反應(yīng)中往往涉及到一些內(nèi)在分子的調(diào)控，其中就包括Bax、Bcl-2和p53三種蛋白.Bcl家族成員在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，而成員Bax和Bcl-2又分別為正負(fù)調(diào)控因子.當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白升高時(shí)，凋亡趨勢(shì)減弱；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白升高時(shí)，能夠通過引起線粒體通透性改變、細(xì)胞色素c釋放等激活線粒體凋亡途徑來促使細(xì)胞發(fā)生凋亡.因此，二者的蛋白比例變化對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用［12］.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在經(jīng)過β-氧化石竹烯處理48 h后細(xì)胞內(nèi)的Bax和Bcl-2表達(dá)水平藥物依賴性的分別上調(diào)和下調(diào)，導(dǎo)致Bax/Bcl-2的比例升高，從而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡.p53蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以通過調(diào)控Bax/Bcl-2，F(xiàn)as/Apol，IGFBP3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用［13］.Western blot的結(jié)果顯示p53蛋白的表達(dá)量同樣在藥物濃度依賴性的上調(diào)，從而通過上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)以激活線粒體凋亡途徑來完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用.

總之，本研究在細(xì)胞水平上檢測(cè)了β-氧化石竹烯對(duì)四種腫瘤細(xì)胞增殖影響，明確了其對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的選擇性抑制效果，并初步對(duì)β-氧化石竹烯在Hela細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了研究，而更具體的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.