楚文慶 董 武

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古通遼 025000）

布病是由布魯氏菌屬細(xì)菌所引起的一種廣泛分布于世界各地的人獸共患傳染。布病的主要傳染源是牛、羊、豬，其中羊的布病對(duì)人的毒力性最強(qiáng)，致病力最高，對(duì)人的健康危害性也最大。

1 材料與儀器

omp22引物，流產(chǎn)型布魯氏桿菌DNA，水，2×Taq酶，移液槍，八連管；

ZR DNA Sequencing Clean-up Kit，PCR擴(kuò)增儀，高速臺(tái)式離心機(jī)，電泳儀，紫外透射反射分析儀，凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)；Nano Drop超微量分光光度計(jì)；甲醛溶液（40%，4%，0.4%），新潔爾滅溶液（30g/L，3g/L，0.3g/L），離心管，純化柱。

2 方法步驟

（1）DNA擴(kuò)增：①引物稀釋：分別向omp22上下游引物加入228 μl與286 μL去離子水，振蕩離心；取10 μl稀釋液加入90 μl的水混合震蕩離心。

②配制擴(kuò)增體系：加入25 μl的2×Taq酶，引物各2.5 μl，2 μl的DNA，18 μl的水至八連管中，混勻封好。

③設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)：stage1：95℃×1，1min；stage2：95℃（15sec）→60℃（15sec）→72℃（30 sec）共計(jì)35個(gè)循環(huán)；stage3：72℃×1（7 min）→4℃保存。

④電泳：配制2%的瓊脂糖凝膠電泳（其中加入GV-Ⅱ熒光染料），依次加入mark與DNA樣本，95℃進(jìn)行30 min的電泳。

⑤凝膠回收：

⑥Ligation：

成分 體積10×T4DNA Ligation Buffer 1μl T4DNA Ligase（3U/μl） 1μl PGM-T載體（50ng/μl） 1μl目的片段 2μl ddH2O 5μl

（2）無(wú)害化處理布魯氏桿菌

①將測(cè)序結(jié)果可用且濃度為200ng/μl的DNA稀釋到40ng/μl，取出10μl的40ng/μlDNA于已經(jīng)做好標(biāo)記的1.5 ml的離心管（tube）中；

②將不同種類不同濃度的消毒劑按照與DNA1：1的比例混合到tube中，使DNA處理時(shí)間分別為10 min，30 min，1 h以及12h；

③將處理過(guò)的DNA進(jìn)行純化，把②中的混合液轉(zhuǎn)移到純化柱中，加入240 μlSequencing Binding Buffer，離心12000 rpm，30 s；

④加入300 μl的Wash Buffer 12000rpm，30 s；

⑤重復(fù)步驟④兩次；

⑥加Elution Buffer 20 μl，換一個(gè)新tube，離心12000 r，30 s；

⑦電泳：PCR總反應(yīng)為30 μl體系，2×Taq酶10μl，上下游布魯氏菌OMP引物1.5μl，DNA 1.5μl，去離子水15.5μl。95℃作用5 min，進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸7 min，4℃forever。

2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓90V，時(shí)間30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察。

3 結(jié)果分析

PFA時(shí)間依存性

不一樣濃度多聚甲醛處置對(duì)布病DNA產(chǎn)量的影響。使用不同濃度的PFA處理布病DNA，10 min，30 min，1 h以及12h后純化DNA產(chǎn)量PFA溶液不同時(shí)間不同濃度來(lái)處理布魯氏桿菌與對(duì)照組一樣，都在500bp片段左右產(chǎn)生明亮的條帶。不同濃度（1%，2%和4%PFA）處理30min與12h后，與對(duì)照組相比，4%PFA總DNA濃度顯著，但30minPFA處理的DNA總量相比于對(duì)照組有所減少，所以用4%PFA處理布氏桿菌30min即可。