劉亞欣 曲宏博 項 祎

（河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北農(nóng)業(yè)大學創(chuàng)新免疫實驗，河北 保定 071000）

口蹄疫（foot- -and- mouth disease，F(xiàn)MD），又稱口瘡熱，是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄類動物共思的急性、熱性、接觸性傳染病，也是人畜共患的傳染病。主要感染牛、豬、羊、駱駝等家畜及野生的偶蹄類動物。[2]在過去的幾百年里，F(xiàn)MD弱毒疫苗和滅活疫苗在預防和控制FMD的過程中發(fā)揮著重要作用，但同時也存在疫苗株毒力返強，病毒逃逸或滅活不徹底等危險。

病毒必須進入宿主細胞，到達細胞內(nèi)的特定區(qū)域才能啟動并完成自我復制，通常 DNA 病毒需要進入細胞核，而RNA 病毒需要到達細胞核周的區(qū)域。[3]新型疫苗的研究過程中發(fā)現(xiàn)病毒與宿主細胞的相互作用是復雜的，其中，F(xiàn)MDV編碼的L pro在抗宿主先天性免疫方面發(fā)揮著重要作用，包括轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平。L pro通過切割宿主的eIF4G，關(guān)閉宿主帽子依賴的翻譯，影響細胞因子的翻譯和主要組織相容性復合體的表達，在機體產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)之前，快速利用宿主的原料合成出大量的子代病毒。[4]

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 淋巴細胞增殖實驗

RPMI-1640完全細胞培養(yǎng)基購自上海冠導生物工程有限公司。CCK-8試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。三蒸水，75%酒精，1.8%生理鹽水均由本實驗室配制保存。PBS購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。ConA購自 Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 ELISA

動物干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 淋巴細胞增殖試驗

于超凈臺內(nèi)將清潔級小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡5分鐘，用紗布吸干小鼠體表的酒精，嚴格按照無菌操作的要求。

在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口取出脾臟。用生理鹽水漂洗一次， 放于含有3mL RPM1-1640完全細胞培養(yǎng)基的平皿。在脾兩端剪一小口，將淋巴細胞吹出來，直至脾發(fā)白。收集平皿中的細胞液至4mL離心管中，離心2000r/min，5 min，棄上清。加入1mL三蒸水30-40s左右裂解紅細胞，再用等量1.8%生理鹽水調(diào)至等滲，離心2000r/min，5min，棄上清。最后將沉淀細胞用100μIRPMI-1640完全細胞培養(yǎng)基重懸，取20μl進行細胞計數(shù)，并且用等量臺盼藍檢測活性細胞百分比（活細胞數(shù)大于97%）。將剩下的細胞懸液用細胞培養(yǎng)基調(diào)整成2.5×106/mL的脾細胞懸液，從配好的懸液里取400μl到1.5mL離心管中，加入3.2μL的ConA，分4個孔，每孔100μL； 再取400μL懸液到1.5mL離心管中，加入3.2μL的完全細胞培養(yǎng)液，將細胞懸夜加入96孔細胞培養(yǎng)板中，置37"C， 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每天搖動。培養(yǎng)結(jié)束前4h，于培養(yǎng)板中加入1μg/μl CCK-8液，10μL/孔， 繼續(xù)培養(yǎng)至所需時，用讀板機在波長450 nm處測定A值。

1.3 ELASA試驗

（1）使用前，將所有試劑充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。

（2）確定所需的板條數(shù)目。樣本（含標準品）和空白都應(yīng)做復孔。

（3）加樣：在標準品孔中加入100μl稀釋后的Cytokine standard （細胞因子標準） ，在樣本孔中加入100μl樣品，在空白對照孔中加入100μl Dilution bufferR（1 x） （稀釋液R ）。

（4）加檢測抗體：每孔加入50μl Biotinylated antibody （生物素基化的抗體）工作液?；靹蚝?，蓋上封板膜，37℃溫育90分鐘。

（5）洗板：扣去孔內(nèi)液體，每孔加入300μl 1xWashing buffer（洗滌緩沖液）工作液。停留1分鐘后棄去孔內(nèi)液體。重復4次，每一次在濾紙上扣干。

（6）加酶： 每孔加入100μl Streptavidin-HRP （鏈霉親和素）工作液。蓋上封板膜，37℃溫育30分鐘。

（7）洗板：重復步驟5。

（8）顯色：每孔加入100μl TMB （過氧化酶的新底物），37 °C避光溫育5-30分鐘，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺（深藍色）來判定終止反應(yīng)。通常顯色10-20分鐘可以達到很好的效果。

（9）終止反應(yīng)：每孔迅速加入100μl Stop solution （停止液）終止反應(yīng)。

（10）讀板：終止后10分鐘內(nèi)，用檢測波長450 nm讀值。

1 2 3 4 5 6 7 5 9 10 11 12 A 0.704 O.672 0.627 0.626 0.593 0.652 0.615 0.649 0.625 0.666 1.063 O.654 B 0.655 0.514 0.716 0.629 0.046 0.046 0.245 0.544 0.045 0.046 0.216 0.655 C 0.716 0.652 0.642 0.714 0.045 0.046 0.235 0.519 0.047 0.047 0.047 0.750 D 0.699 0.515 0.359 0.356 0.046 0.045 0.237 0.475 0.046 0.045 0.046 0.745 E 0.599 0.510 0.252 0.259 0.047 0.045 0.235 0.443 0.046 0.047 0.201 0.705 F 0.673 0.232 0.530 0.654 0.046 0.047 0.225 0.539 0.047 0.047 0.050 0.543 G 0.653 0.444 0.446 0.569 0.046 0.046 0.245 0.459 0.046 0.046 0.045 0.624 H 0.923 0.655 0.772 0.705 0.732 0.705 0.725 0.716 0.716 0.733 0.955 0.769

2 結(jié)果

2.1 鑒定口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能誘導小鼠淋巴細胞增殖

實驗顯示未加人刺激物培養(yǎng)的對照組中除少量自增殖外，沒有發(fā)生明顯的增殖改變。而加人ConA共同培養(yǎng)的刺激組細胞則發(fā)生了顯著的增殖，實驗組隨著濃度的增加吸光度A值增大，這個結(jié)果說明了這個生長因子具有促進細胞增殖的作用。

2.2 口蹄疫樣顆粒刺激小鼠產(chǎn)生更多的外周血細胞因子

為了驗證病毒樣顆粒如何刺激小鼠產(chǎn)生更多的外周血細胞因子，在每個標準品孔加入100 μl稀釋后的Cytokine standard （細胞因子標準） ，每個樣品孔加入100 μl樣本，每個空白對照孔加入100 μl Dilution bufferR（1 x） （稀釋液R ）。加生物素基化的抗體、鏈霉親和素后，實驗顯示外周血細胞因子增多。

對照組實驗組

3 討論

口蹄疫的多血清型及型間無交叉保護，為口蹄疫的控制帶來巨大困難。在新型疫苗進入實際應(yīng)用前，還需對此類疫苗的免疫機制和分子生物學特性作更深入地研究。[5]已有研究表明口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能夠增強機體的免疫能力，抑制FMDV VLPs在機體內(nèi)的生長繁殖。那么闡明口蹄疫病毒樣顆粒疫苗對機體免疫機制的增強作用，則有利于對FMD進行有效的防控提供科學依據(jù)。本文首先驗證出，口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能刺激淋巴細胞分化，之后通過ELIS A實驗得出該疫苗能剌激機體產(chǎn)生更多的外周血細胞因子，從而調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫。

4 結(jié)論

口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能刺激機體淋巴細胞分化，同時使機體產(chǎn)生更多的記憶細胞，分泌更多IFN-γ。由此可知，口蹄疫病毒樣顆粒疫苗能夠通過刺激淋巴細胞分化來增強機體免疫應(yīng)答功能，并且使機體產(chǎn)生更多的記憶細胞來應(yīng)對FMDV VLPs二次感染機體，同時使機體分泌更多IFN-γ以抑制FMDV VLPs在機體內(nèi)的生長繁殖。