吳曉靜 姜?jiǎng)欧?蔣 穎 李杰俊

南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇 南京 210019

一氧化氮（NO）參與了炎癥反應(yīng)過(guò)程，高表達(dá)一氧化氮合酶（iNOS）和NO過(guò)量產(chǎn)生是關(guān)節(jié)炎[1]、膿毒血癥[2]等病癥的病理環(huán)節(jié)?？寡资蔷姆ǖ钠毡樾孕?yīng)規(guī)律[3]。我們前期的研究已經(jīng)證明了TRPV1介導(dǎo)溫和灸對(duì)于氟氏佐劑炎癥模型的抗炎[4]和鎮(zhèn)痛[5]中的作用。辣椒素（TRPV1激動(dòng)劑）抑制LPS和IFN-γ介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS和產(chǎn)生NO[6]；隔餅灸有效降低膝關(guān)節(jié)炎模型兔血清、關(guān)節(jié)滑液和軟骨中的iNOS含量，減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷[7]。溫和灸是否通過(guò)TRPV1介導(dǎo)影響了iNOS——炎癥的普遍性環(huán)節(jié)？我們?cè)O(shè)計(jì)本研究試圖回答該問(wèn)題。總結(jié)匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：本研究由兩部分實(shí)驗(yàn)組成，分述如下。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)一：“TRPV1拮抗劑影響溫和灸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎癥模型小鼠的抗炎效應(yīng)及與iNOS的相關(guān)性”。利用辣椒平（TRPV1拮抗劑）阻斷溫和灸效應(yīng)途徑，觀察辣椒平對(duì)溫和灸抗炎效應(yīng)及其iNOS的影響。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)二：“溫和灸對(duì)TRPV1-/-佐劑性關(guān)節(jié)炎癥模型小鼠iNOS的影響”。對(duì)比觀察溫和灸對(duì)TRPV1-/-模型小鼠及其野生型小鼠抗炎作用、影響iNOS的差異。

1.2 動(dòng)物及分組：分述如下。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)一：健康成年昆明（KM）雄性小鼠50只，體重35±2g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)2007000547161），隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、溫和灸組、辣椒平組、溫和灸+辣椒平組，每組各10只。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)二：C57BL/6野生型小鼠16只（體重16～20g）、J003770TRPV1基因敲除小鼠16只，體重17～20g（南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)20100001）。分組：C57BL/6野生型小鼠隨機(jī)分為野生模型組和野生溫和灸組，每組各8只。16只TRPV1基因敲除小鼠隨機(jī)分為KO模型組和KO溫和灸組，每組各8只。

1.3 造模：實(shí)驗(yàn)第1天，將20μl完全弗氏佐劑（sigma公司）皮內(nèi)注射于小鼠右后足跖，監(jiān)測(cè)小鼠足跖容積。24h之后，根據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分表，對(duì)模型小鼠足跖關(guān)節(jié)進(jìn)行評(píng)定，若分?jǐn)?shù)＞4分，則表示造模成功。

1.4 干預(yù)方法：分述如下。

1.4.1 溫和灸組：選取小鼠脊柱L5、L6區(qū)域，備皮，暴露1cm×1cm皮膚，特制細(xì)艾條（5mm×200mm，南陽(yáng)漢醫(yī)有限公司）于選定區(qū)域懸灸20min，燃燒端距離皮膚12±2mm。同時(shí)，測(cè)溫儀（HC-04型，杭州洪昌科技有限公司）監(jiān)測(cè)小鼠施灸部位皮膚溫度，保持在44±1℃。

1.4.2 辣椒平組：辣椒平溶于二甲基亞砜，生理鹽水稀釋配備為0.01%辣椒平溶液。從實(shí)驗(yàn)第2d起，小鼠腹腔注射辣椒平0.1ml/10g，每天1次，總共7d。

1.4.3 溫和灸+辣椒平組：給予小鼠腹腔注射辣椒平（劑量同辣椒平組），15min后溫和灸（方法同溫和灸組）。干預(yù)時(shí)間：實(shí)驗(yàn)第2至第8d。

1.5 指標(biāo)測(cè)量：分述如下。

1.5.1 足跖腫脹度：足跖容積測(cè)量?jī)x（YLS-7B，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）測(cè)量各組小鼠的右后足跖容積。測(cè)量時(shí)間：第1、2、4、6、8d。

1.5.2 血清指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)第8d，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠行摘眼球取血。每只1.5ml，離心分離血清，收集0.5ml血清至1.5ml離心管，-20℃冰箱中保存。酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）檢測(cè)血清TNF-α，IL-1β；血清中硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量；比色法檢測(cè)iNOS含量。所有檢測(cè)由江蘇省南京凱基生物有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示。實(shí)驗(yàn)中各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，在滿足正態(tài)分布和方差齊性的情況下采用單因素方差分析LSD法進(jìn)行多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辣椒平干預(yù)處理對(duì)溫和灸及佐劑性關(guān)節(jié)炎模型小鼠的抗炎效應(yīng)及其iNOS的影響：分述如下。

2.1.1 足跖腫脹度：如表1所示，實(shí)驗(yàn)第8d，模型組足趾腫脹度高于正常組（P＜0.01），表明造模成功；溫和灸組、辣椒平組、溫灸+辣椒平組足趾腫脹度均低于模型組（P＜0.01），表明三組干預(yù)均可改善CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎模型小鼠的足趾腫脹度；溫和灸組足趾腫脹度明顯低于溫和灸+辣椒平組（P＜0.05），表明辣椒平降低了溫和灸對(duì)模型小鼠足趾腫脹度的影響。

表1 溫和灸、辣椒平、溫和灸+辣椒平對(duì)CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足跖腫脹度影響（±s，ml，n=10）

表1 溫和灸、辣椒平、溫和灸+辣椒平對(duì)CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足跖腫脹度影響（±s，ml，n=10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與溫和灸組比較：#P＜0.05。

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2.1.2 炎癥因子：如表2所示，實(shí)驗(yàn)第8d，模型組IL-1β、TNF-α、NO、iNOS明顯高于正常組（P＜0.01）；溫和灸組、辣椒平組、溫和灸+辣椒平組IL-1β、TNF-α、NO、iNOS均明顯低于模型組（P＜0.01）；辣椒平組、溫和灸+辣椒平組IL-1β、TNF-α、NO、iNOS明顯低于溫和灸組（P＜0.01）。

表2 溫和灸、辣椒平、溫和灸+辣椒平對(duì)CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠IL-1β、TNF-α、NO、iNOS的影響（±s，n=10）

表2 溫和灸、辣椒平、溫和灸+辣椒平對(duì)CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠IL-1β、TNF-α、NO、iNOS的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與溫和灸組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組溫和灸組辣椒平組溫和灸+辣椒平組iNOS（U/ml）0.41±0.23 22.14±0.94▲▲6.33±0.72▲▲**9.18±1.28▲▲**##14.8 ±1.10▲▲**##IL-1β（pg/ml）31.39±1.86 83.45±8.61▲▲34.65±3.74▲▲**50.55±1.27▲▲**##71.02±1.85▲▲**##TNF-α（pg/ml）24.82±1.65 66.29±3.44▲▲31.00±1.22▲▲**37.18±1.08▲▲**##51.85±1.61▲▲**##NO(μmol/L)4.96±1.94 83.93±2.63▲▲30.87±1.12▲▲**36.38±2.21▲▲**##37.84±2.59▲▲**##

2.2 溫和灸對(duì)TRPV1-/-佐劑性關(guān)節(jié)炎模型小鼠的抗炎效應(yīng)及與iNOS的影響：分述如下。

2.2.1 足跖腫脹度：如表3所示，實(shí)驗(yàn)第8d，與野生模型組相比，野生溫灸組足趾腫脹度有明顯下降（P＜0.01）；與TRPV1-/-模型組相比，TRPV1-/-溫和灸組足趾腫脹度沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。

表3 溫和灸對(duì)TRPV1-/-、野生型CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足跖腫脹度的影響（±s，ml，n=8）

表3 溫和灸對(duì)TRPV1-/-、野生型CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足跖腫脹度的影響（±s，ml，n=8）

注：與野生模型組比較：**P＜0.01。

組別野生模型組野生溫和灸組TRPV1-/-模型組TRPV1-/-溫和灸組Day 8 0.302±0.016 0.259±0.017**0.292±0.003 0.280±0.010 Day 1 0.171±0.012 0.177±0.010 0.153±0.011 0.159±0.008 Day 2 0.256±0.014 0.250±0.019 0.283±0.016 0.287±0.033 Day 4 0.262±0.018 0.253±0.019 0.280±0.015 0.288±0.018 Day 6 0.311±0.029 0.286±0.014 0.290±0.025 0.286±0.012

2.2.2 炎癥因子：如表4所示，實(shí)驗(yàn)第8d，與野生模型組相比，野生溫和灸組血清IL-1β、TNF-α、NO含量、iNOS活性有明顯下降（P＜0.01）；與TRPV1-/-模型組相比，TRPV1-/-溫和灸組 IL-1β、TNF-α 無(wú)明顯變化（P＞0.05）。TRPV1-/-溫和灸組小鼠經(jīng)過(guò)7d溫和灸后血清中NO含量、iNOS活性與TRPV1-/-模型組小鼠相當(dāng)（P＞0.05）。

表4 溫和灸對(duì)TRPV1-/-、野生型CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠IL-1β、TNF-α、血清NO含量、iNOS活性的影響（±s，n=8）

表4 溫和灸對(duì)TRPV1-/-、野生型CFA佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠IL-1β、TNF-α、血清NO含量、iNOS活性的影響（±s，n=8）

注：與野生模型組比較，**P＜0.01。

組別野生模型組野生溫和灸組TRPV1-/-模型組TRPV1-/-溫和灸組IL-1β（pg/ml）82.93±3.39 65.99±5.45**79.98±1.67 75.44±2.05 TNF-α（pg/ml）58.63±1.96 38.06±1.52**44.98±1.95 44.39±2.01 NO(μmol/L)49.45±2.91 26.36±0.89**67.10±1.52 64.57±2.09 iNOS（U/ml）17.50±0.73 8.78±1.06**12.41±0.31 11.61±0.49

3 討論

TRPV1是溫和灸抗炎的分子效應(yīng)途徑。通過(guò)觀察溫和灸對(duì)炎癥模型的影響，我們驗(yàn)證了溫和灸的抗炎效應(yīng)由TRPV1介導(dǎo)，TRPV1是溫和灸的主要效應(yīng)途徑[4]。

TRPV1介導(dǎo)iNOS表達(dá)下調(diào)是艾灸抗炎效應(yīng)途徑之一。外周血細(xì)胞均表達(dá)TRPV1[9]，而NO是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)。iNOS在單位時(shí)間內(nèi)釋放的NO量比結(jié)構(gòu)型NOS（內(nèi)皮源性eNOS、神經(jīng)元性nNOS）大1000倍[10]。TRPV1在炎癥的加劇與發(fā)展相關(guān)，NO水平降低是相關(guān)表現(xiàn)之一[11]。iNOS抑制劑在感染性休克實(shí)驗(yàn)中顯示了療效[12]，目前臨床缺少有效以iNOS為靶向治療的特異性藥物治療方法。因此，本研究的結(jié)果為臨床運(yùn)用灸法抑制炎癥反應(yīng)提供了理論依據(jù)。

溫和灸下調(diào)iNOS、降低NO量為艾灸治療臨床危重急癥提供支撐。文獻(xiàn)記載神闕灸是古代危重急癥的常見(jiàn)急救措施[13]。iNOS源性NO是炎癥反應(yīng)中炎癥遞質(zhì)瀑布樣連鎖反應(yīng)的最終共同遞質(zhì)之一，也是導(dǎo)致感染性休克的關(guān)鍵遞質(zhì)[14]，是感染性休克血壓降低、微循環(huán)障礙的關(guān)鍵分子[15]。iNOS源的NO釋放量增加是感染性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）的主要病理環(huán)節(jié)。在本研究結(jié)論的基礎(chǔ)上，臨床結(jié)合腧穴的部位特異性（如神闕）可以進(jìn)一步放大抑制iNOS、降低NO量的治療靶向性，提高臨床治療效力；同時(shí)避免iNOS抑制劑的副反應(yīng)[16]。

展望：在明確了TRPV1介導(dǎo)溫和灸抗炎、降低iNOS表達(dá)的機(jī)制基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究溫和灸抗應(yīng)激的iNOS機(jī)制以及針對(duì)不同病理靶向的有效應(yīng)用于臨床的溫和灸操作方法具有可行性。