陳宗池 蔡清強 房太勇

【摘要】 目的：探討Claudin-3與結直腸癌的發(fā)生、浸潤、轉移之間的相關性。方法：收集筆者所在醫(yī)院2016年9月-2017年6月結直腸癌組織（32例）、結直腸腺瘤組織（25例）及正常結直腸組織（25例），采用Western blot檢測各組織中Claudin-3的表達情況。結果：Claudin-3在結腸癌組的表達水平（0.915 89±0.690 15）明顯高于結直腸腺瘤組（0.477 48±0.337 80）、正常結直腸組（0.203 15±0.218 27），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;伴有淋巴結轉移組Claudin-3水平（1.296 04±0.490 18）顯著高于無淋巴結轉移組（0.485 04±0.650 92），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;高分化組Claudin-3水平（0.135 52±0.176 06）低于中分化組（0.881 25±0.676 63），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;中分化組Claudin-3水平（0.881 25±0.676 63）也低于低分化組（1.485 91±0.375 22），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而Claudin-3水平與患者年齡、性別及腫瘤大小、部位無關。結論：Claudin-3與結直腸癌的發(fā)生及分化程度、轉移密切相關，而與患者年齡、性別及腫瘤大小、部位無關;Claudin-3有可能成為結直腸癌早期診斷的檢測指標，并可能為臨床治療結直腸癌提供潛在的治療靶點。

【關鍵詞】 結直腸癌; Claudin-3; 蛋白免疫印跡法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.001 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）17-000-03

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between Claudin-3 and the occurrence，invasion and metastasis of colorectal cancer.Method：Colorectal cancer tissues（32 cases），colorectal adenoma tissues（25 cases） and normal colorectal tissues（25 cases） were collected from September 2016 to June 2017.All tissues were detected by Western blot.The expression of Claudin-3.Result：The expression level of in Claudin-3 in colon cancer group（0.915 89±0.690 15） was significantly higher than that colorectal adenoma group（0.477 48±0.337 80），normal colon group（0.203 15±0.218 27），the differences were significant（P<0.05），and lymph node metastasis group（1.296 04±0.490 18） was significantly higher than the no lymph node metastasis group（0.485 04±0.650 92），the difference was significant（P<0.05），the expression level in the highly differentiated group（0.135 52±0.176 06） was lower than that in the moderately differentiated group（0.881 25±0.676 63），the difference was significant（P<0.05）.The expression level of the moderately differentiated group（0.881 25±0.676 63）was also lower than that of the poorly differentiated group（1.485 91±0.375 22），the difference was significant（P<0.05），but not related to the patients age，gender，tumor size and location.Conclusion：Claudin-3 is closely related to the occurrence and differentiation of colorectal cancer，and it is not related to the age，sex，tumor size and location of patients.Claudin-3 may be a marker for early diagnosis of colorectal cancer，and may be clinical treatment of colorectal cancer provides a potential therapeutic target.

【Key words】 Colorectal cancer; Claudin-3; Western blot

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

目前，我國結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）發(fā)病位居惡性腫瘤第4位，近年來仍有上升趨勢，且總體上的預后較差，嚴重威脅人類健康[1]。但其具體的發(fā)病機制尚不明確，而上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的研究越來越受到人們的重視。有研究證實，在癌癥的發(fā)生及進展過程中EMT起到了重要作用，其主要表現(xiàn)是在腫瘤邊緣細胞處破壞緊密連接結構。緊密連接（tight junction，TJ）是相鄰細胞膜共同構成的一個屏障。TJ與細胞的增殖、分化的調控和腫瘤細胞的轉移有關[2]。緊密連接蛋白（claudin）是TJ的主要結構蛋白之一。有關于Claudin-3在結直腸癌中表達的相關性研究已有報道，但是對于Claudin-3的表達與CRC發(fā)生、轉移、預后之間的相關性目前報道少見，并且尚沒有明確的定論。本研究通過檢測Claudin-3在不同病理參數(shù)的CRC組織、腺瘤組織及正常結直腸組織中的表達水平變化。探討Claudin-3與CRC的發(fā)生、浸潤、轉移之間的相關性，為結直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及了解其預后提供新途徑，繼而為臨床結直腸癌治療提供潛在的藥物治療新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年9月-2017年6月在筆者所在醫(yī)院治療的結直腸癌、結直腸腺瘤患者及門診健康體檢者82例，其中結直腸癌組32例，平均年齡（60±14）歲;結直腸腺瘤組25例，平均年齡（54±11）歲;正常結直腸組25例，平均年齡（45±14）歲。所有研究對象均知情同意并由醫(yī)院倫理委員會審批同意，所有患者術前未進行新輔助放化療、生物治療等其他抗腫瘤治療，無合并其他惡性腫瘤、炎癥性腸病等，均有完整的臨床病理資料，組織標本均保持完整，由兩名專業(yè)的病理科醫(yī)生進行病理診斷確診，并行Claudin-3蛋白免疫印跡（Western blot，WB）檢測。

1.2 儀器及材料

鼠抗人Claudin-3多克隆抗體、羊抗鼠單克隆IgG抗體、GAPDH抗體、BCA蛋白定量分析試劑盒、BB5060型CO2孵箱、ECL發(fā)光掃描儀、蛋白電泳儀、蛋白核酸定量儀（power PAC 2000型）等。

1.3 實驗步驟及檢測項目

1.3.1 病理檢查及HE染色 取每例部分組織標本進行固定、脫水、包埋、切片，進行HE染色觀察各組標本顯微鏡下的形態(tài)學改變，并區(qū)分結直腸癌組織的病理特征。

1.3.2 WB檢測各組織中Claudin-3表達水平 取剩余組織標本-80 ℃凍存組織，進行組織裂解，按照BCA法測定蛋白質濃度，將剩余的蛋白提取液制定成蛋白樣品，再通過電泳、轉膜，進行抗體雜交，進行曝光底片，多次重復后掃描照片，采集圖片信息并處理分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，對于符合正態(tài)分布且方差齊的兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗，對于方差不齊的采用近似t檢驗;相關性分析采用Spearman分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組、結直腸腺瘤組、正常結直腸組的病理及HE染色

結果見圖1。正常結直腸組（HE×400），腺體排列規(guī)則，未見擁擠融合，核未見異性性;結直腸腺瘤組（HE×400），腺體呈管狀，排列規(guī)則，未見融合、背靠背現(xiàn)象、間質浸潤，核輕度異性，位于基底層，無病理性核分裂;結直腸癌組（HE×400），腺體不規(guī)則，呈背靠背融合，可見成角及壞死，間質纖維化、浸潤。細胞重度異型，核分裂多見，并可見病理性核分裂。

2.2 結直腸癌組、結直腸腺瘤組、正常結直腸組中Claudin-3的表達

結直腸癌組中的Claudin-3表達水平明顯高于結直腸腺瘤組，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.123，P<0.05）;結直腸癌組中Claudin-3表達水平也顯著高于正常結直腸組，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.459，P<0.05），見圖2、表1。Spearman相關性分析顯示Claudin-3的表達水平在正常結直腸組、結直腸腺瘤組、CRC組中呈中度正相關（r=0.490，P=0.000）。

2.3 Claudin-3在不同臨床病理參數(shù)CRC患者中的表達

2.3.1 淋巴結轉移 與結直腸癌組伴隨淋巴結轉移中的Claudin-3表達水平相比，無淋巴結轉移的結直腸癌組中的Claudin-3表達水平明顯低，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.010，P<0.05），見表2。Spearman相關性分析顯示Claudin-3的表達水平與有無淋巴結轉移呈中度正相關（r=0.675，P=0.000）。

2.3.2 遠處轉移 本研究中，遠處轉移病例只有1例，表達水平為2.164 38，較無遠處轉移組（0.875 62±0.668 54）明顯高，但遠處轉移例數(shù)太少，無法進行統(tǒng)計學分析。

2.3.3 TNM分期 Ⅲ期結直腸癌組中的Claudin-3表達水平顯著高于Ⅰ期結直腸癌組和Ⅱ期結直腸癌組，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.185、2.943，P=0.001、0.007），見表3。Ⅳ期僅1例，不參與統(tǒng)計學比較。Spearman相關性分析顯示Claudin-3的表達差異在CRC不同TNM分期中具有高度的正相關性（r=0.709，P=0.000）。

2.3.4 組織學分級 Claudin-3在組織學分級中的高分化（1級）中的表達結果低于中分化（2級），差異有統(tǒng)計學意義（t=2.406，P=0.025）;中分化的表達水平也低于低分化，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.362，P=0.026），見表4;Spearman相關性分析顯示Claudin-3的表達水平在高分化組、中分化、低分化組中依次升高，呈中度正相關（r=0.650，P=0.000）。

2.3.5 其他臨床病理參數(shù) Claudin-3在CRC組織中的表達水平與患者年齡、性別及腫瘤大小、部位無關，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表5。

3 討論

TJ是細胞黏附的主要方式之一，調控著細胞旁通路的通透性，保持細胞極性。Claudin是構成TJ的主要蛋白之一，Claudin的表達水平的改變會使得細胞極性破壞、細胞黏附能力下降，與腫瘤的發(fā)生、進展及預后密切相關，但其確切的發(fā)生機制尚不清楚。

本文研究結果顯示，結直腸癌組中的緊密連接蛋白-3的表達水平明顯高于結直腸腺瘤組及正常結直腸組，另外，結直腸腺瘤組的緊密連接-3蛋白量也顯著高于正常結直腸組。Spearman分析提示Claudin-3的表達水平呈中度正相關。Tokuhara等[3]通過體外細胞研究同樣發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白-3在CRC細胞中呈高表達，提示Claudin-3表達的上調可能參與惡性腫瘤的發(fā)生。目前對于其具體作用機制尚未完全明確。但有研究報道，當Claudin蛋白的表達異常時，使得上皮細胞對細胞旁通路通透性的調節(jié)異常及獲取侵襲表型從而向具有可以活動特性的間質細胞轉化，促進癌癥的發(fā)生[4]。

目前對于Claudin-3在CRC組織中的表達水平上升的機制仍未完全清楚。Wang等[5]通過小鼠動物模型對CRC組織中的Claudin-3蛋白表達情況的改變進行體內、外研究，研究表明，Claudin-3在CRC組織中的水平可通過SCF/c-kit/JNK/AP-1信號轉導通路的激活可以使之升高，Claudin-3的異常表達可能與CRC的發(fā)生有關。表明Claudin-3有可能成為CRC早期診斷的檢測指標。

對于不同分化程度，Claudin-3的表達水平隨著CRC分化程度的不同差異明顯，分化程度越低，腫瘤惡性度越高，Claudin-3的水平越高。Claudin-3除了“屏障和柵欄”功能外，在細增增殖、分化中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)[6-7]。Escudero-Esparza等[8]研究認為，緊密連接蛋白的表達異常使得腫瘤細胞早期出現(xiàn)黏附能力的丟失，細胞旁通路調節(jié)受損及細胞之間的信號轉導通路受到阻礙，而在腫瘤生長晚期的時候，這種內環(huán)境的改變令細胞極性丟失和細胞在生長、分化上出現(xiàn)差異。

同時發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移組中的緊密連接蛋白-3的水平顯著高于無淋巴結轉移組，相關性分析顯示呈正相關。研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞轉移的重要步驟是對間皮細胞和內皮細胞的侵襲[9]，而腫瘤轉移涉及到一系列的級聯(lián)反應，只有完成這些級聯(lián)反應，癌細胞才能轉移到遠處。而要完成上述轉移級聯(lián)反應時，必須得破壞TJ的屏障作用，導致細胞極性和細胞的黏附能力丟失。Claudin在癌癥細胞黏附功能的丟失、轉移過程起著非常重要的作用。因此，破壞Claudin蛋白維持TJ的完整性是轉移級聯(lián)反應發(fā)生的關鍵步驟。其他學者研究發(fā)現(xiàn)Claudin-3在其他癌組織中同樣具有類似的結果[10-11]。Tokuhara等[3]通過對體外細胞研究發(fā)現(xiàn)，從CRC患者的轉移淋巴結中分離出來的SW620細胞中Claudin-3的表達水平顯著升高，并且SW620細胞具有顯著的轉移特征，提示著Claudin-3的異常表達可能與腫瘤的侵襲、轉移相關。而CRC患者的年齡、性別及腫瘤大小、部位與CRC組織Claudin-3的表達水平無關，差異無統(tǒng)計學意義。

而在治療方面，靶向藥物治療是目前惡性腫瘤治療的熱點研究方向。產氣莢膜梭菌腸毒素是Claudin-3第二胞外環(huán)的高親和力天然配體，可以與Claudin-3結合形成膜孔復合物，使得細胞迅速死亡，并且Claudin-3在人類CRC、食管癌、上皮性卵巢癌等癌癥組織中均呈高表達，這為Claudin成為靶向治療惡性腫瘤提供了可能性。并且Pahle等[12]已經報道了產氣莢膜梭菌腸毒素基因在體內外進行基因轉移靶向治療結腸癌成功的應用。綜上所述，提示Claudin-3有可能成為CRC早期診斷的檢測指標，并可能成為臨床治療CRC提供治療靶點。

目前國內對Claudin-3在CRC組織的異常表達的研究較少，本研究不僅分析了Claudin-3在結直腸腺瘤與CRC之間的表達差異;同時分析了Claudin-3的異常表達與CRC不同病理參數(shù)之間的關系，探討Claudin-3有可能成為CRC早期診斷的檢測指標。但本研究樣本量較小，缺少對Claudin-3相關機制及調節(jié)劑的研究及研究時間短;以期能多中心合作，擴大樣本量，為Claudin-3能否成為CRC早期診斷的檢測指標及臨床治療CRC提供治療靶點提供更多依據(jù)。

參考文獻

[1]杜靈彬，李輝章，王悠清，等.2013年中國結直腸癌發(fā)病與死亡分析[J].中華腫瘤雜志，2017，39（9）：701-706.

[2]馮璐，胡曉松，李娟.緊密連接蛋白-3與腫瘤[J].華西醫(yī)學，2015（12）：2360-2363.

[3] Tokuhara Y，Morinishi T，Matsunaga T，et al.Nuclear expression of Claudin-3 in human colorectal adenocarcinoma cell lines and tissues[J].Oncology Letters，2018，15（1）：99-108.

[4]于鳳嬌，達林泰.Claudins蛋白與惡性腫瘤轉移相關性的研究進展[J].醫(yī)學綜述，2017，23（7）：1316-1319.

[5] Wang Y，Sun T，Sun H，et al.SCF/C-Kit/JNK/AP-1 Signaling Pathway Promotes Claudin-3 Expression in Colonic Epithelium and Colorectal Carcinoma[J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（4）：765.

[6] Hieda Y.Assembly of tight junction molecules in the developing mouse submandibular gland[J].Journal of Osaka Dental University，2017，47（2）：233-240.

[7] Kuvacheva N V，Morgun A V，Malinovskaya N A，et al.Tight junction proteins of cerebral endothelial cells in early postnatal development[J].Cell & Tissue Biology，2016，10（5）：372-377.

[8] Escudero-Esparza A，Jiang W G，Martin T A.The Claudin family and its role in cancer and metastasis[J].Frontiers in Bioscience，2011，16（1）：1069.

[9] Scalici J M，Arapovic S，Saks E J，et al.Mesothelium expression of vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1） is associated with an unfavorable prognosis in epithelial otvarian cancer（EOC）[J].Cancer，2017，123（6）：977.

[10] Miku?apietrasik J，Sosińska P，Maksin K，et al.Colorectal cancer-promoting activity of the senescent peritoneal mesothelium[J].Oncotarget，2015，6（30）：29178-29195.

[11]駱麗，馬國榮，劉鳳閣，等.緊密連接蛋白-1、3、4在乳腺癌患者中的表達及其臨床意義[J].疑難病雜志，2017，16（6）：610-613.

[12] Pahle J，Menzel L，Niesler N，et al.Rapid eradication of colon carcinoma by Clostridium perfringens Enterotoxin suicidal gene therapy[J].Bmc Cancer，2017，17（1）：129.

（收稿日期：2019-01-14） （本文編輯：何玉勤）