魏春華，夏 偉，李 娜，馬 英，吳熠丹，虞慧云，戴愛(ài)玲，楊小燕，劉建奎

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心,福建 龍巖364000)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種具有高度傳染性的繁殖障礙和呼吸道疾病,該病自1987 年在美國(guó)首次報(bào)道以來(lái),相繼在全世界范圍暴發(fā),給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。

PRRSV 基因組為不分節(jié)段,有囊膜的單股正鏈RNA 病毒,基因組長(zhǎng)約15 kb,含有至少10 個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)[5-7]。PRRSV 基因組存在高度的變異,Nsp2、ORF3、ORF5a 和ORF5 基因高度變異,ORF5 基因的變異情況在很大程度上可以反映PRRS 基因組的遺傳變異特征,因此國(guó)內(nèi)外研究人員常以其作為靶基因研究毒株的遺傳變異[8-11]。ORF5 基因所編碼的GP5 蛋白是PRRSV 主要的中和抗原和結(jié)構(gòu)蛋白之一,其良好的免疫原性能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng),是研制PRRS 基因工程疫苗的首選。Shi 等(2010)收集8624 株ORF5 基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示,PRRSV 可分為9 個(gè)譜系(lineage),每個(gè)譜系的毒株又可劃分為不同的亞型,呈現(xiàn)出PRRSV 遺傳多樣性[11]。我國(guó)2006 年暴發(fā)的HP-PRRSV 處于lineage 8.7,2013 年爆發(fā)的NADC30-like PRRSV 處于lineage 1。此外,我國(guó)PRRSV 還存在lineage 3(QYYZlike PRRSV)和lineage 5.1(VR-2332 like PRRSV)兩個(gè)譜系的毒株。

本試驗(yàn)從福建地區(qū)采集的病料樣本中分離到1株P(guān)RRSV,通過(guò)RT-PCR、間接免疫熒光和ORF5 基因序列測(cè)定對(duì)其進(jìn)行鑒定,同時(shí)測(cè)定了其在Marc-145 細(xì)胞上的TCID50,證實(shí)分離毒株FJFQ1805 為譜系3 的毒株。

1 材料與方法

1.1 豬場(chǎng)發(fā)病情況及樣品采集 2018 年4 月,福建省福州市某豬場(chǎng)疑似PRRS 感染,該場(chǎng)病豬臨床表現(xiàn)為食欲減退、精神不振,體溫升高(40 ℃～41 ℃),呼吸困難,耳朵、下腹發(fā)紺,妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎。剖檢可見(jiàn)肺間質(zhì)增寬,頜下、肺門(mén)、腹股溝等部位淋巴結(jié)等不同程度腫脹、充血。無(wú)菌采集病豬的肺臟、淋巴結(jié)等組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 DNA Marker 2 000、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、Recombinant RNase Inhibitor(40 U/μL)、Reverse Transcriptase M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL),購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；RNA 提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗鼠lgG 熒光抗體(FITC 標(biāo)記)為美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì) 按照參考文獻(xiàn)[12]方法設(shè)計(jì)歐洲型PRRSV ORF5 引物,引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成,擴(kuò)增目的片段的大小約為700 bp。

1.4 病料的處理 將無(wú)菌采集病豬的肺臟、淋巴結(jié)等組織剪碎,充分研磨,反復(fù)凍融3 次,離心后取上清液備用。

1.5 病毒分離 將處理過(guò)的病料上清液接種于長(zhǎng)滿單層的Marc-145 細(xì)胞,PBS 洗滌后加入適量的DMEM 維持溶液,于37 ℃恒溫條件下的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞病變(CPE)。當(dāng)細(xì)胞變圓、皺縮、細(xì)胞核固縮脫落時(shí)達(dá)到80%以上時(shí)收毒,反復(fù)冰凍融解數(shù)次。以3 000 r/min 離心10 min 后,取上清液并儲(chǔ)存在-70 ℃。

1.6 分離病毒的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè) PRRSV接種到長(zhǎng)成單層的Marc-145 細(xì)胞的培養(yǎng)板中,37 ℃吸附1 h 后棄接種液,PBS 清洗后,加入適量的DMEM 維持液于每孔中,置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)48 h,設(shè)正常細(xì)胞作對(duì)照。細(xì)胞出現(xiàn)病變后,利用冷的甲醇固定法進(jìn)行固定,20 min 后棄固定液,PBS 清洗3 次,后每孔加入200 μL 稀釋的PRRSV N 蛋白鼠源單克隆抗體(MAb,1∶800),37 ℃作用2 h,PBS 輕柔的清洗3 次,將稀釋后的FITC-羊抗鼠IgG 加入每孔中,在37 ℃條件下放置1 h,PBS 清洗3次,待其干燥后倒置在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.7 TCID50的測(cè)定 將DMEM 培養(yǎng)基10 倍梯度稀釋的第4 代病毒(10-1～10-10)接種至已長(zhǎng)成單層Marc-145 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔100 μL,每個(gè)梯度做4 個(gè)重復(fù),37 ℃吸附1 h,棄去病毒液,每孔加入100 μL 維持液,置于37 ℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)6 d,每天觀察并記錄CPE,根據(jù)Reed-Muench 方法計(jì)算TCID50。

1.8 分離病毒的ORF5 基因的RT-PCR 擴(kuò)增及序列分析 病毒液RNA 的提取按照RNAsimple Total RNA Kit 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。按照說(shuō)明書(shū)制備其cDNA,以其為模板進(jìn)行ORF5 基因的PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃4 min；94 ℃45 s、55 ℃45 s、72 ℃45 s,35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min,同時(shí)設(shè)不加模板的陰性對(duì)照。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后克隆至pMD19-T 載體上,鑒定為陽(yáng)性的重組菌由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。 采用DNAStar Lasergene 7.1 程序中的CLUSTAL W 程序?qū)RF5 基因進(jìn)行多序列比對(duì)。用MEGA 6.0 軟件中的鄰近法(Neighbor-joining tree with 10,00 bootstrap)對(duì)ORF5 基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒接種細(xì)胞 將采集的病料樣品處理后接種Marc-145 細(xì)胞后5 d 后細(xì)胞出現(xiàn)聚集成叢、變圓、脫落等典型的CPE,表明分離株能夠在Marc-145 細(xì)胞上增殖(見(jiàn)中插彩版圖1)。

2.2 PRRSV 的間接免疫熒光鑒定結(jié)果 對(duì)分離獲得的病毒采用PRRSV N 蛋白MAb 進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示,被感染的細(xì)胞可以被抗PRRSV的特異性單抗所識(shí)別,被感染的細(xì)胞有特異性的熒光(見(jiàn)中插彩版圖2)。表明成功分離到了PRRSV,將分離的病毒株命名為FJFQ1805。

2.3 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 分離的病毒接種細(xì)胞后經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果顯示,獲得了約為700 bp 目的片段,與預(yù)期相符(圖3),表明已經(jīng)成功分離PRRSV。

圖3 PRRSV ORF5 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 PRRSV 分離株TCID50的測(cè)定 將10 倍梯度稀釋后的分離株FJFQ1805 的第4 代接種長(zhǎng)滿單層Marc-145 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,按照Reed-Muench 法計(jì)算得到該分離株的TICD50為105.3。

2.5 ORF5 基因及推導(dǎo)氨基酸序列的變異分析測(cè)序結(jié)果顯示,FJFQ1805 ORF5 基因核苷酸長(zhǎng)度為603 bp,編碼200 aa。通過(guò)DNAStar Lasergene 軟件對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示,分離株FJFQ1805 ORF5 基因與參考毒株典毒株VR2332、CH-1a 和BJ-4 的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為83.9%～85.9%和81.0%～83.6%；與TJ、HuN4 和JXA1 等HP-PRRSV 的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為85.1%和82.5 ～82.6%；與NADC30、CHsx1401 株和FJZ03 的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為84.2%～85.6%和83.0%～85.5%；與FJFS、GM2 和QYYZ 等譜系3中PRRSV 的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為91.5%～92.2%和90.5%～92.0%；而與歐洲代表毒株LV 的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別62.6%和55.1%。 結(jié)果表明,所分離的FJFQ1805 毒株為新流行的譜系3 的毒株。

2.6 ORF5 基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 基于ORF5 遺傳進(jìn)化分析,可將北美型PRRSV 分為4 個(gè)譜系,即以VR2332、BJ-4 為代表的譜系5.1,以CH-1a、JXwn06、JXAl 和HUN4 等為代表的譜系8.7,以NADC30、CHsx1401、FJZ03 等為代表的譜系1,以及以GM2、QYYZ 和FJFS 為代表的譜系3(圖4)。構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示,分離株FJFQ1805 與福建毒株FJFS 及廣東分離株QYYZ 和GM2 親緣關(guān)系較近,處于同一進(jìn)化分支,而與譜系8.7、譜系5.1 和譜系1 的代表毒株處于不同的進(jìn)化分支,親緣關(guān)系遠(yuǎn)。由此表明,分離株FJFQ1805 毒株為譜系3 毒株(圖4)。

圖4 FJFQ1805 毒株與參考毒株ORF5 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.7 ORF5 基因編碼的氨基酸序列分析 利用DNAStar Lasergene 軟件中的Megalign 程序,將所測(cè)的PRRSV GP5 序列與國(guó)內(nèi)外常用的參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析,結(jié)果顯示,ORF5 基因編碼的氨基酸存在多處的突變,其中變異程度最大的區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽區(qū)域(aa1 ～aa25),除此之外還存在多處散在的氨基酸變異位點(diǎn)。GP5 蛋白胞外區(qū)aa37 ～aa45(S37H(L/F)QLIYNL45)是PRRSV 主要的中和抗原表位[13-15],其中H38和I42YN44被認(rèn)為是PRRSV 中和表位的識(shí)別位點(diǎn),L/F39QL41被認(rèn)為是PRRSV 中和表位的結(jié)合位點(diǎn)[14-15]。 譜系3 中的毒株FJFS、QYYZ、GM2 和FJFQ1805 存在H38→Y38和L39→S39的變異(圖5)。PRRSV GP5 蛋白有兩個(gè)位點(diǎn)(R13和R151)被認(rèn)為是潛在的病毒毒力相關(guān)位點(diǎn)。FJFQ1805 毒株存 在R13→Q13和R151→K151的 變 異。與HP-PRRSV、VR2332、NADC30 和CH-1a 相比,FJFS、QYYZ、GM2 和FJFQ1805 在第25(F/L25→S25)、26(A26→I26)、38(H38→Y38)、66(S/T66→C66)、92(A/G92→S92)、117(L117→F117)、199(R199→H199)位氨基酸發(fā)生了特征性的突變(圖5),表明譜系3的毒株與其他譜系的毒株相比發(fā)生了較大程度的變異。

圖5 PRRSV GP5 序列分析

3 討論

PRRS 已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一,我國(guó)自1996 年開(kāi)始流行PRRS,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害,2006 年在我國(guó)南爆發(fā)的HP-PRRS,迅速蔓延至全國(guó)各地并成為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)毒株。2013年福建省開(kāi)始流行NADC30-like PRRSV,為豬場(chǎng)防控PRRS 帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn),2017 年lineage 3 PRRSV 呈現(xiàn)小范圍流行,進(jìn)一步加劇了PRRS 的防控難度[16]。

本試驗(yàn)對(duì)分離株FJFQ1805 和12 株參考毒株的GP5 同源性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,FJFQ1805 與經(jīng)典株(VR2332、CH-1a、BJ-4)氨基酸同源性為81.0%～83.6%；與高致病性毒株(HuN4、JXA1、TJ)氨基酸同源性為82.5%～82.6%；與NADC30-like PRRSV(NADC30、FJZ03、CHsx1401)氨基酸同源性為83.0%～85.5%；與譜系3 的毒株QYYZ、GM2 和FJFS 氨基酸同源性最高為90.5% ～92.0%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示,分離株FJFQ1805 和譜系3 中的毒株FJFS、QYYZ 和GM2處于同一進(jìn)化分支,親緣關(guān)系較近,而與經(jīng)典毒株、HP-PRRSV 和NADC30-like PRRSV 處于不同進(jìn)化分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),表明分離株FJFQ1805為譜系3 的毒株。

GP5 蛋白是PRRSV 的重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一,具有的良好的抗原性,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和病毒的中和抗體,而高變異的GP5 可能會(huì)影響機(jī)體抗GP5 抗體效價(jià)和交叉保護(hù)率[17-18]。與HP-PRRSV、VR2332 和CH-1a 相比,譜系3 中的毒株FJFQ1805、QYYZ、GM2 和FJFS 在第25(F/L25→S25)、26(A26→I26)、38(H38→Y38)、66(S/T66→C66)、92(A/G92→S92)、117(L117→F117)和199(R199→H199)位氨基酸發(fā)生了特征性的突變,尤其在中和表位B(S37H(L/F)QLIYNL45)存在H38→Y38和L/F39→S39的變異,這些變異可能會(huì)導(dǎo)致GP5 蛋白抗原性發(fā)生變化,并影響病毒與中和抗體有效的識(shí)別,從而導(dǎo)致病毒逃逸機(jī)體免疫應(yīng)答,造成免疫失敗。

目前譜系3 的毒株在福建省呈現(xiàn)小范圍流行,但是該類(lèi)毒株出現(xiàn)時(shí)間較短,病毒的來(lái)源、致病性、生物學(xué)特性等尚且不清楚,因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)該類(lèi)毒株的防控,尤其是對(duì)跨地區(qū)引種或生豬貿(mào)易,應(yīng)加強(qiáng)檢疫和生物安全,避免豬場(chǎng)引入新的毒株。譜系3 的毒株與現(xiàn)有的疫苗株RespPRRSV MLV 和HPPRRSV 疫苗株處于不同遺傳分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),現(xiàn)有的弱毒疫苗是否能對(duì)其起到良好的免疫保護(hù)作用需要進(jìn)一步研究。