張婷婷，劉夢志，馮 生，孫創(chuàng)業(yè)，陳澤良，劉寶山，沈國順

(沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧 沈陽110866)

布魯菌病(Brucellosis,簡稱布病)是由布魯菌(Brucella)引起的人獸共患慢性傳染病,羊、牛、豬等動物最易感染,主要引起母畜傳染性流產[1]。人類由于接觸帶菌動物或者食用病畜及其乳制品可引發(fā)感染[1]。目前該病流行于世界各個地方,發(fā)展中國家尤為嚴重。在中亞國家,人布病的流行形勢在不斷惡化[1-2],在我國也廣泛流行。近年來,我國部分地區(qū)有再度流行的趨勢[3],給人們的日常生活和生產帶來了嚴重危害和巨大的經濟損失。

布魯菌是胞內寄生菌,抗菌藥物治療效果不顯著,很難根治,這就造成了該病的反復發(fā)作[11]。目前布病的防治主要以疫苗免疫為主,然而現(xiàn)有的A19、S2 等弱毒苗的免疫效果不理想[4],而且疫苗免疫抗體和野毒感染抗體無法進行區(qū)分,給養(yǎng)殖場的布病凈化帶來很大困難。在這種情況下,開發(fā)新的基因缺失標記疫苗成為熱點[5]。牛布魯菌病A19-ΔVirB12 活疫苗是以A19 株為親本株,缺失布魯菌IV 型分泌系統(tǒng)中VirB12 基因的基因缺失疫苗[6-7]。免疫動物可以通過VirB12 蛋白抗體的存在與否來判斷區(qū)分疫苗免疫抗體和野毒感染抗體,彌補了以往疫苗的缺陷,有利于布病的預防和凈化,從而保護人的健康和安全。

VirB12 基因屬于布魯菌 IV 型分泌系統(tǒng)(T4SS)。 IV 型分泌系統(tǒng)由分別命名為VirB1-VirB12 的12 個不同的VirB 蛋白構成,形成貫穿細菌壁和外膜的復合體,與布魯菌在宿主細胞內的生存、復制、免疫應答有關[8]。VirB12 蛋白在胞內運輸過程中發(fā)揮重要作用,并且可作為一種布魯菌血清學檢測標記抗原[9]。本試驗構建了VirB12 的短小芽孢桿菌分泌型表達系統(tǒng),用以獲取大量VirB12蛋白,為建立基于VirB12 蛋白的檢測方法以區(qū)分疫苗免疫抗體和野毒感染抗體提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料 布魯菌菌株和血清:布魯菌標準陽性血清,購自中國生物制品鑒定所；A19-ΔVirB12 免疫陽性血清和B.abrotus A19 菌株由新疆天康畜牧生物技術股份有限公司贈予。

1.2 載體及菌株 短小芽孢桿菌表達系統(tǒng)試劑盒(Cat.#HB300),購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 抗體及試劑 6×His 單克隆抗體、HRP 標記的蛋白G、2×Premix Taq、PVDF Immobilon-P Transfer Membranes、限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ等,購自北京全式金生物技術有限公司；HRP 標記的山羊抗牛二抗、HRP 標記的山羊抗鼠二抗、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、膠回收試劑盒、DAB 顯色試劑盒等,購自索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國產。

1.4 方法

1.4.1 引物的設計與合成 根據(jù)NCBI 上發(fā)表的牛型布魯菌(Brucella abrotus)VirB12 基因序列(Gen-Bank:AF226278.1),使用分子生物學軟件Prime premier 5.0 設計并合成了1 對引物:VirB12-F:5′-GATGACGATGACAAAGGATCCTCTCTGGCCGCTTGTTCC-3′(ggatcc 為BamHⅠ酶切位點),VirB12-R:5′-CATCCTGTTAAGCTTGTCGACTTACTTGCGTAAAATTTCGATATCC-3′(gtcgac 為Sal I 酶切位點)。為簡化試驗步驟,引物兩端分別設計了重組克隆序列和限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ的酶切位點。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 VirB12 基因的PCR 擴增及回收 以牛布魯菌A19 的煮沸裂解產物為模板進行VirB12 基因組的PCR 擴增,反應條件為:94 ℃預變性4 min；94 ℃變性35 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,35 個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。做50 μL 反應體系。反應結束后取5 μL PCR 產物進行1.5%瓊脂糖核酸凝膠電泳鑒定擴增效果。

1.4.3 重組表達質粒的構建及鑒定 用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收VirB12 目的條帶。按照短小芽孢桿菌表達系統(tǒng)試劑盒的操作程序將回收好的VirB12 目的基因片段重組克隆到pBIC1 質粒上并轉化到短小芽孢桿菌中,然后均勻涂布在含新霉素(50 μg/mL)的2SY 固體培養(yǎng)基平板。挑選克隆菌落,接種于含新霉素(50 μg/mL)的2SY 液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取菌液進行質粒抽提,然后對獲取的質粒進行PCR 和雙酶切鑒定,鑒定正確的質粒送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.4.4 重組陽性菌的誘導表達 將鑒定正確的VirB12 重組表達菌株接種于4 mL 含新霉素(50 μg/mL)的2SY 液體培養(yǎng)基中,在30 ℃～33 ℃條件下120 r/min 振蕩培養(yǎng)72 小時,進行誘導表達。表達結束后,取1 mL 的菌液5 000 r/min 離心5 min。分別取上清和沉淀樣品,用上樣緩沖溶液處理后通過15%SDS-PAGE 進行鑒定。

1.4.5 重組蛋白的鑒定 菌液上清經15% SDSPAGE 分離后,電轉至PVDF 膜上,以1%的BSA 在37 ℃條件下封閉1.5 h,然后分別以6×His 單克隆抗體(1 ∶500 稀釋)及牛布魯菌陽性標準血清(1∶100 稀釋)作為一抗,以HRP 標記的山羊抗鼠血清(1∶1 000 稀釋)和HRP 標記的山羊抗牛血清做二抗(1∶5 000 稀釋)孵育30 min,洗滌后用DAB 顯色,蒸餾水終止反應。

2 結果

2.1 VirB12 基因的擴增 PCR 擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后,在500 bp 附近出現(xiàn)了一條擴增條帶(圖1),與預期目的片段519 bp 大小相符,表明擴增出了VirB12 目的基因。

圖1 B12 基因PCR 擴增產物

2.2 重組表達質粒鑒定 提取克隆菌的質粒,進行BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切和PCR 擴增,產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,可看到在500 bp 附近都出現(xiàn)了基因片段(圖2),DNA 測序結果經BLAST對比鑒定為布魯菌VirB12 序列。

圖2 pBIC1-B12 質粒的鑒定

2.3 VirB12 蛋白的誘導表達 重組菌誘導表達產物經過15%SDS-PAGE 分析顯示,菌液上清中出現(xiàn)了特異的22 kDa 的蛋白條帶(圖3),與預期的目的蛋白大小相符,表達蛋白的含量高達80%。菌體沉淀中沒有明顯的條帶出現(xiàn),表明表達蛋白為分泌表達。

圖3 重組陽性菌的誘導表達及鑒定

2.4 VirB12 蛋白的鑒定 分別使用6His 單抗和牛布魯菌陽性血清做一抗的Western-Blot 結果表明,在22 kDa 處均出現(xiàn)了顯著的免疫印跡條帶(圖4 A,B),位置和SDS-PAGE 電泳位置相符,而作為陰性對照的芽孢桿菌樣品沒有出現(xiàn)免疫印跡條帶,表明誘導表達的蛋白為VirB12 的6×His 融合蛋白,其能與牛布魯菌標準陽性血清發(fā)生反應,具有良好的反應原性；而以A19-ΔVirB12 免疫牛的陽性血清做一抗的Western-Blot 中沒有出現(xiàn)該條帶(未展示),說明A19-ΔVirB12 疫苗免疫的陽性血清中不含有VirB12 蛋白的抗體。

圖4 B12 重組蛋白的鑒定

3 討論

布魯菌作為危害人獸安全與健康的病原菌之一,備受關注。布魯菌分為六個種屬19 個亞型,分別是馬耳他布魯菌(羊型布魯菌)3 個亞型、流產布魯菌(牛型布魯菌)8 個亞型、豬布魯菌5 個亞型、狗布魯菌1 個亞型、林鼠布魯菌1 個亞型和綿羊布魯菌1 個亞型。而且近幾年還發(fā)現(xiàn)了海洋種[1]。其中羊種、牛種、豬種和狗種布魯菌能夠通過受傷皮膚、黏膜直接感染人類,并引發(fā)一系列的臨床癥狀,嚴重危害人們的健康。

布魯菌是兼性細胞內寄生菌,能夠感染吞噬細胞和非吞噬細胞,在感染哺乳動物時,巨噬細胞是主要的結合靶點[10]。其中T4ss 分泌系統(tǒng)參與布魯菌在胞內的增殖。T4ss 分泌系統(tǒng)通過改變寄生細胞的細胞器來達到自我的復制[11]。VirB12 作為T4ss 分泌系統(tǒng)編碼的一個基因,能夠在感染細胞過程中產生毒性蛋白[12],并且能夠產生相應的抗體,可作為血清學標記檢測布魯菌[9]。

盡管現(xiàn)有的A19、S2 等弱毒苗的免疫效果不理想,但使用疫苗免疫接種仍然是防控布魯菌病最有效的方法,然而現(xiàn)有的疫苗無明顯的基因標識,無法從血清學水平來區(qū)別野毒感染和疫苗免疫血清,在這種情況下,開發(fā)新的基因缺失標記疫苗成為熱點[7]。牛布魯菌病A19-ΔVirB12 活疫苗是以A19株為親本株,缺失布魯菌IV 型分泌系統(tǒng)中VirB12基因的基因缺失疫苗[6],填補了現(xiàn)有弱毒疫苗和滅活疫苗無法在血清學水平來鑒別診斷布病野毒感染的缺陷。以其為抗原建立ELISA 方法,可以在只免疫A19-ΔVirB12 活疫苗的養(yǎng)殖場檢出野毒感染動物。A19-ΔVirB12 活疫苗和VirB12 抗體ELISA 配套使用,可以凈化養(yǎng)殖場中的布病野毒,減少布病帶來的經濟損失,保障人員安全。

本試驗成功構建了VirB12 蛋白的短小芽孢桿菌表達菌,可以在上清中大量表達具有反應活性的VirB12 蛋白,含量達80%,方便制備和純化,為其應用于布病野毒的篩檢做了前期準備。