劉 航，何佳琪，王小鳳，李明奇，郭 嘉，趙天藝，張 樊，吳長(zhǎng)新，張 輝

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

布魯菌病是我國(guó)二類(lèi)動(dòng)物疫病，是一種人獸共患傳染病。家畜感染布魯菌的臨床癥狀一般表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大，體溫升高，母畜表現(xiàn)為流產(chǎn)和死胎。目前，布病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷升高[1]，各國(guó)都加強(qiáng)了對(duì)布魯菌病的重視，以避免布病帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失和對(duì)公共衛(wèi)生的危害[2]。

布魯菌病引起母畜流產(chǎn)是由于胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞受到了損害[3]，而布魯菌的經(jīng)典毒力因子有脂多糖、四型分泌系統(tǒng)[4]、外膜蛋白以及Bvr R/Bvr S雙組分系統(tǒng)等[5]。在布魯菌造成機(jī)體慢性感染的過(guò)程中，四型分泌系統(tǒng)起著重要的作用，其分泌的效應(yīng)因子可以引起機(jī)體各方面的紊亂，這些效應(yīng)因子的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)類(lèi)以及核蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)相似。在機(jī)體被其感染后可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-18等多種炎癥因子并引發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。IL-1β和TNF-α等促炎因子在機(jī)體抵抗病原過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。我們?cè)谇捌谘芯恐?，已篩選出了布魯菌的一個(gè)效應(yīng)分子VceA，并證實(shí)了其在弱毒株中的表達(dá)量低于強(qiáng)毒株。但是VceA在布魯菌感染機(jī)體的過(guò)程中功能尚不明確。本研究培養(yǎng)布魯菌S2308的VceA基因缺失株，分析其生長(zhǎng)特點(diǎn)并與親本株做比較。布魯菌VceA基因缺失株侵染HTP-8細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌水平進(jìn)行檢測(cè)；用ΔVceA感染小鼠，采集脾臟組織，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。本研究為進(jìn)一步探究T4SS分泌蛋白VceA的功能提供理論基礎(chǔ)，對(duì)于有效的防控布魯菌病，維護(hù)社會(huì)公共衛(wèi)生安全有著重大意義。

1 材料與方法

1.1 菌株布魯菌2308株由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；布魯菌VceA基因缺失株由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物27只SPF級(jí)BALB/c小鼠，5-7周齡，雌性，體重（20±2）g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.3 試劑布魯菌固體培養(yǎng)基（BrucellaAgar）和液體培養(yǎng)基（BrucellaBroth）均購(gòu)自BD公司；氨 青霉素以及卡那青霉素購(gòu)自Pfizer公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 布魯菌的培養(yǎng)將保存在-80℃冰箱的布魯菌S2308和S2308的基因缺失株ΔVceA取出，于超凈生物安全柜中在布魯菌固體培養(yǎng)基上“四區(qū)法”畫(huà)線，密封，37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)2 d。

1.5 牛種布魯菌ΔVceA生長(zhǎng)特性檢測(cè) 分別挑取S2308的基因缺失株ΔVceA單克隆菌落置于布魯菌液體培養(yǎng)基中200 r/min、37℃培養(yǎng)至D600為0.1時(shí)，每隔120 min收取一次菌液，滅活檢測(cè)D600的值，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.6 HPT-8細(xì)胞的侵染及細(xì)胞因子的檢測(cè)

1.6.1 細(xì)菌侵染細(xì)胞 使用6孔板進(jìn)行細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，按照侵染復(fù)數(shù)MOI=100∶1將布魯菌加至細(xì)胞上清液中，混勻后置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中1 h；每孔加入3.5 μL/mL硫酸慶大霉素作用50 min后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液；PBS清洗3次后添加新的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.6.2 侵染HPT-8細(xì)胞后細(xì)胞因子的檢測(cè) 分別用S2308和ΔVceA侵染HPT-8細(xì)胞，并于3 h、12 h、24 h收取細(xì)胞上清液，并分別用TNF-α和IL-1β的ELISA試劑盒檢測(cè)其表達(dá)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.7 侵染HPT-8細(xì)胞后CFU計(jì)數(shù)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HPT-8細(xì)胞移至新的6孔板中，每孔細(xì)胞個(gè)數(shù)約為106。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，加入生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌量為108的布魯菌S2308株和ΔVceA，分別在侵染3 h、12 h 和24 h時(shí)用曲拉通裂解細(xì)胞，梯度稀釋后涂布至布魯菌固體培養(yǎng)基，密封，37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)3 d，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。

圖1 炎性細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of inflammatory cytokines

1.8 感染小鼠模型的建立將保存在-80℃冰箱的布魯菌S2308和S2308的基因缺失株ΔVceA取出，于生物安全柜中在布魯菌固體培養(yǎng)基上“四區(qū)法”畫(huà)線，密封，37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)2～3 d，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。每組9只小鼠，每只小鼠腹腔注射200 μL CFU計(jì)數(shù)為5×106moL/L的布魯菌S2308株和S2308的基因缺失株ΔVceA，對(duì)照組的小鼠腹腔注射等量的PBS緩沖液。

1.9 小鼠脾臟的CFU計(jì)數(shù)分別于兩組小鼠腹腔注射布魯菌后第1 d、7 d、14 d、28 d、56 d時(shí)，在無(wú)菌環(huán)境中取出小鼠脾臟，將脾臟組織剪碎后放入無(wú)菌的EP管中，加入800 μL的PBS進(jìn)行30 min勻漿，用PBS緩沖液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)? d、7 d、14 d時(shí)用103和104的稀釋度涂布布魯菌固體培養(yǎng)基，第28 d、56 d時(shí)選用102和103稀釋度涂布，密封，37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)3 d后計(jì)算生長(zhǎng)的菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 布魯菌S2308株ΔVceA及其親本株S2308生長(zhǎng)曲線 通過(guò)觀察布魯菌S2308株ΔVceA及S2308的生長(zhǎng)曲線，布魯菌S2308株ΔVceA與S2308生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期的時(shí)間分別是12 h和24 h，見(jiàn)圖2。S2308株ΔVceA及S2308的生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異，這表明布魯菌VceA基因的缺失不影響布魯菌的生長(zhǎng)。

圖2 布魯菌S2308ΔVceA與其親本株S2308的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The gowth curve of Brucella S2308 ΔVceA strains and S2308 strain

2.2 VceA 缺失株對(duì)HPT-8細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌的影響在布魯菌侵染HPT-8細(xì)胞3 h、12 h和24 h時(shí)收取上清液，根據(jù)檢測(cè)TNF-α和IL-1β炎癥因子的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀在D450處測(cè)定吸光值，然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式來(lái)計(jì)算TNF-α和IL-1β的濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3。在布魯菌侵染細(xì)胞后3 h、12 h和24 h時(shí)，侵染組TNF-α和IL-1β的分泌量均高于對(duì)照組，在布魯菌侵染細(xì)胞后12 h時(shí)親本株組的TNF-α和IL-1β的分泌量均高于缺失株組。

2.3 牛布魯菌ΔVceA侵染HPT-8細(xì)胞后及感染小鼠后的CFU計(jì)數(shù) 布魯菌ΔVceA及其親本株S2308以100∶1侵染復(fù)數(shù)侵染HPT-8細(xì)胞，在侵染后第0 h、3 h、12 h、24 h時(shí)用曲拉通裂解細(xì)胞，收樣稀釋到102和103后分別涂布至布魯菌固體培養(yǎng)基，密封，37℃倒置培養(yǎng)3～5 d后計(jì)算菌落數(shù)，繪制折線圖（圖4A）。結(jié)果顯示，布魯氏菌ΔVceA在侵染12 h時(shí)CFU計(jì)數(shù)顯著低于親本株，在侵染24 h時(shí)和親本株S2308差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

兩組小鼠腹腔注射后，于感染后第1 d、7 d、14 d、28 d 和56 d時(shí)無(wú)菌取出小鼠脾臟，勻漿后加入PBS梯度稀釋?zhuān)坎贾敛剪斁腆w培養(yǎng)基，密封，37℃倒置恒溫培養(yǎng)3～5 d后計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4B，ΔVceA在感染后第14 d時(shí)顯著低于親本株（P<0.01），之后有上升的趨勢(shì)，在第28 d時(shí)和親本株差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 細(xì)胞因子表達(dá)量Fig.3 The expressions of cytokines

3 討論

布魯菌的T4SS是一種多蛋白復(fù)合體，研究布魯菌T4SS對(duì)研究布魯菌的致病機(jī)理有很大幫助[8]。T4SS首次被發(fā)現(xiàn)時(shí)的效應(yīng)因子就有VceA，其分泌的效應(yīng)因子能夠幫助布魯菌在細(xì)胞內(nèi)的生存，對(duì)機(jī)體持續(xù)造成感染[9]。研究表明，T4SS分泌的效應(yīng)蛋白VceA是由105個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在已公布的布魯菌基因組中都是保守的，VceA編碼的蛋白質(zhì)是T4SS的蛋白新底物[10-12]。

圖4 牛布魯菌ΔVceA和S2308在HPT-8細(xì)胞中的存活能力和在小鼠脾臟中的載菌量Fig.4 Survival ability of Brucella bovis ΔVceA and S2308 in HPT-8 cells and their carrying capacity in mouse spleen

布魯菌感染機(jī)體后，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞均能快速識(shí)別病原菌的入侵，釋放的促炎因子在感染初期對(duì)NLRP3炎癥小體有暫時(shí)的抑制作用，并通過(guò)這條途徑抑制相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達(dá)，而胞外其他致炎因子的表達(dá)量也會(huì)因?yàn)镮L-1β和IL-18分泌到胞外的刺激而升高。史靜雪等[15]在對(duì)VceA研究中發(fā)現(xiàn)，VceA蛋白刺激細(xì)胞后，細(xì)胞的炎性因子IL-1β、IL-18、TGF-β1和TNF-α的表達(dá)量均有不同程度的升高。劉來(lái)珍等[14]在研究布魯菌T4SS分泌蛋白功能時(shí)也證實(shí)了其對(duì)細(xì)胞因子IL-1β的釋放具有一定的作用。本研究中布魯菌侵染組TNF-α和IL-1β的分泌量均高于PBS對(duì)照組、親本株組均高于布魯菌的ΔVceA基因缺失株組，在感染的過(guò)程中這些細(xì)胞因子分泌量的變化可能與布魯菌胞內(nèi)寄生機(jī)制相關(guān)。

本研究用布魯菌S2308基因缺失株ΔVceA侵染HTP-8細(xì)胞以及構(gòu)建小鼠感染模型，通過(guò)觀察繪制的布魯菌的生長(zhǎng)曲線可以看出，布魯菌S2308 ΔVceA缺失株和親本株在生長(zhǎng)趨勢(shì)上基本一致，證明VceA基因的缺失對(duì)布魯菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。脾臟作為動(dòng)物體內(nèi)的免疫器官，從小鼠感染布魯菌的模型采集的脾臟組織進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)[16]，缺失株感染初期顯著低于親本株，之后和親本株并無(wú)明顯差異，這些變化與布魯菌在體內(nèi)生存能力有著很大關(guān)系，為進(jìn)一步探索布魯菌四型分泌系統(tǒng)，揭示其致病機(jī)理提供依據(jù)。