李珮瑤，高晶萍，梁 亭，羅 強，李 軍，徐明舉，徐 彤,，張瑞華

（1.河北北方學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，張家口 075000；2.河北北方學(xué)院 生命科學(xué)研究中心，張家口 075000）

目前研究已經(jīng)證實H9N2流感病毒不僅可感染家禽和豬，同時也可感染人[1-4]。自1976年人類感染豬流感病毒導(dǎo)致發(fā)病和死亡以來，該病毒不斷在人-豬-禽中傳播[5]。自1992年我國從廣東省分離到H9N2禽流感病毒[6]以來，H9N2亞型禽流感病毒在我國雞群中頻繁發(fā)生。2001年，peiris等[7]證實在中國東南地區(qū)豬群中同時存在H9N2禽流感病毒和H3N2人類流感病毒，并預(yù)測這兩種病毒同時感染豬為該病毒遺傳重組提供機(jī)會，從而引發(fā)人類流感的大流行。2002年，我國大部分豬群中流感抗體監(jiān)測顯示H4、H5和H9呈不同程度陽性。2004年，從山東豬群中分離到H9N2豬流感病毒，證實此病毒為雞源和鴨源H5N1、H9N2重組而成。同年，在河南13個豬場中分離到7株H9N2病毒，并發(fā)現(xiàn)這7株豬源H9N2病毒可以與人類唾液酸（sialic acid，SA）α2-6Gal受體結(jié)合。這種可直接與人類唾液酸受體結(jié)合的特性是目前禽源H5N1和H7N9病毒所不具備的，因此，豬源H9N2病毒比H5N1病毒等更易突破種間屏障而導(dǎo)致人類流感流行[8-10]。近年來，我國四川、湖南、云南等多個省市均陸續(xù)報道此類病例產(chǎn)生[7,11-12]，表明H9N2病毒導(dǎo)致越來越多的人類感染。感染者初始一般表現(xiàn)為輕微呼吸道癥狀，但2016年四川省出現(xiàn)危重的臨床病例[13]。鑒于以上事實，H9N2亞型流感病毒被認(rèn)為是引起人類下次流感流行的潛在毒株之一，因此，研究H9N2亞型流感病毒在感染哺乳動物過程中的適應(yīng)性顯得更加迫切。目前關(guān)于豬源H9N2亞型流感病毒在A549細(xì)胞內(nèi)增殖的相關(guān)研究報道較少，本試驗擬通過對胰酶維持液濃度、吸附時間、細(xì)胞培養(yǎng)液pH值及病毒接種濃度等幾個影響因素的篩選，確定豬源H9N2亞型流感病毒在A549細(xì)胞中增殖的最佳條件，為進(jìn)一步研究H9N2亞型流感病毒致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞豬源流感病毒A/Swine/Hebei/012/2008（H9N2）由河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室分離保存（經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，收獲病毒后測定病毒HA滴度，分裝于-80℃保存）；人肺腺癌上皮細(xì)胞（A549）由河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺、青鏈霉素購自Gibco公司；EDTA-胰蛋白酶、TPCK-胰蛋白酶購自SIGMA公司；細(xì)胞瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板購自COSTAR公司。

1.3 1%雞紅細(xì)胞懸液經(jīng)翅靜脈無菌采取成年公雞血4 mL，與適量抗凝劑混勻，1500×g離心10 min，棄上清液及白細(xì)胞膜，加入適量生理鹽水充分混勻，再次離心棄上清液，如此反復(fù)3次。取紅細(xì)胞沉淀，用滅菌生理鹽水配制1%紅細(xì)胞懸液。

1.4 A549細(xì)胞培養(yǎng)從液氮中取出凍存的A549細(xì)胞，立即37℃水浴融化，離心棄去凍存液，用完全培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS+10 μL/mL谷氨酰胺+青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL）反復(fù)吹打均勻，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層。

1.5 不同胰酶濃度對A549生長的影響待A549細(xì)胞在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上長成單層后，棄去上清液，PBS洗3次（3 min/次），以去除血清蛋白。在1-5列加入500 μL/孔分別含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL TPCK-胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)液，第6列加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液（不含胰酶）作為對照。分別于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.6 H9N2病毒最佳感染劑量的確定用含1 μg/mL的胰酶維持液將病毒（HA滴度為9log2，毒價為104.3TCID50/mL）倍比稀釋成終濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的病毒懸液，取長成單層細(xì)胞的96孔板，PBS洗板3次，以除去殘留血清蛋白及抑制性代謝物，1-7行分別加入濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的病毒懸液各100 μL，第8行為對照（無病毒），吸附1 h后，棄去上清液，加入含0.3 μg/mL胰蛋白酶維持液。接種病毒后每12 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變并取細(xì)胞上清液50 μL按常規(guī)方法[10]測定上清液中HA滴度。

1.7 豬源H9N2亞型流感病毒感染A549最佳胰酶維持液濃度的確定取已完全貼壁、細(xì)胞含量為70%的A549 24孔培養(yǎng)板，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次（3 min/次），1-5列加入百倍稀釋的病毒（稀釋前HA滴度為9log2）懸液500 μL，第6列加入細(xì)胞培養(yǎng)基，置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1 h后，棄去病毒懸液或培養(yǎng)基，1-5列分別加入胰酶濃度為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL的維持液各500 μL，并設(shè)對照組，第6列為只含培養(yǎng)基的空白對照，置37℃、5% CO2溫箱中孵育。接種病毒后每12 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變并取細(xì)胞上清液50 μL按常規(guī)方法[10]測定HA滴度，確定胰酶維持液的最佳濃度。

1.8 豬源H9N2亞型流感病毒感染A549最佳吸附時間的確定取已完全貼壁、A549細(xì)胞含量為70%的6孔培養(yǎng)板4塊，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗板3次（3 min/次），依次加入100倍稀釋的病毒液2 mL，1塊培養(yǎng)板為對照，接種病毒后不吸附；3塊培養(yǎng)板為試驗組，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別吸附1 h、1.5 h、2 h，待吸附時間結(jié)束后棄去病毒液，每孔加入2 mL含0.3 μg/mL的胰酶維持液。于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，72 h后凍融觀察細(xì)胞病變并取細(xì)胞上清液50 μL按標(biāo)準(zhǔn)方法測定HA滴度。

1.9 最佳細(xì)胞培養(yǎng)液pH值的確定取已完全貼壁、A549細(xì)胞含量為70%的24孔培養(yǎng)板，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次（3 min/次），各孔加入100倍稀釋的病毒液500 μL，待吸附時間結(jié)束后棄去病毒液，1-5列分別加入pH值為7.0、7.2、7.5、7.8、8.0的細(xì)胞培養(yǎng)液（含0.3 μg/mL的胰酶）。接毒后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h及72 h后凍融，觀察細(xì)胞病變并取上清液按標(biāo)準(zhǔn)方法測定HA滴度，確定最佳細(xì)胞培養(yǎng)液pH值。

2 結(jié)果

2.1 不同胰酶濃度對A549生長的影響在A549細(xì)胞培養(yǎng)至12 h時，TPCK-胰酶濃度為2.5 μg/mL組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞變圓并伴隨些許細(xì)胞從孔底脫落；在培養(yǎng)至24 h時，2.5 μg/mL組細(xì)胞基本全部破碎裂解為細(xì)胞碎片，2.0 μg/mL組細(xì)胞變圓并有大部分細(xì)胞出現(xiàn)破碎脫落；在培養(yǎng)至48 h時，1.5 μg/mL組細(xì)胞出現(xiàn)相似的細(xì)胞變圓腫脹、脫落及細(xì)胞裂解現(xiàn)象；直至72 h，1.5、2.0、2.5 μg/mL組細(xì)胞均變圓、脫落、破碎，而0.5 μg/mL組與對照組基本無明顯變化。胰酶濃度高于1.0 μg/mL組，A549細(xì)胞出現(xiàn)大量的死亡、破碎現(xiàn)象，其損傷與TPCK-胰蛋白酶濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長呈正相關(guān)。最終確定采用胰酶濃度為1 μg/mL。

2.2 不同的病毒接種濃度對細(xì)胞上清液HA滴度的影響由表1可知，對照組無HA滴度；在培養(yǎng)時間為36 h，病毒接種濃度為10-1和10-2時，細(xì)胞上清液開始出現(xiàn)HA滴度，為1.4log2、1.7log2；在病毒接種濃度為10-2，培養(yǎng)時間為72 h時HA滴度為6.4log2，而經(jīng)反復(fù)凍融后，HA滴度達(dá)到峰值7.2log2；10-3感染組比10-1和10-2感染組的HA滴度出現(xiàn)時間晚12 h；10-5～10-7感染組都沒有產(chǎn)生HA滴度。因此最終確定最佳病毒接種劑量為100 μL（104.3TCID50/mL），最佳病毒接種濃度為10-2。

2.3 不同的胰酶維持液濃度對細(xì)胞上清液HA滴度的影響由表2可知，對照組無HA滴度；培養(yǎng)時間為36 h時，維持液胰酶濃度為0.3 μg/mL和0.4 μg/mL同時出現(xiàn)HA滴度；而隨著培養(yǎng)時間的延長，0.3 μg/mL組HA滴度明顯高于0.4 μg/mL組，在培養(yǎng)時間為72 h并凍融時，HA滴度達(dá)到最高值6.3log2；而胰酶濃度低于0.3 μg/mL和高于0.4 μg/mL時，HA滴度出現(xiàn)時間較晚且均偏低。

2.4 不同的病毒吸附時間對細(xì)胞上清液HA滴度的影響由表3可知，對照組在72 h后才出現(xiàn)較低的HA滴度，3組在培養(yǎng)時間36 h時均產(chǎn)生了HA滴度；吸附1 h組在培養(yǎng)時間為72 h時細(xì)胞上清液的HA值為5log2，反復(fù)凍融后HA效價達(dá)到6.7log2；吸附1.5 h與吸附1 h組HA值相接近，但1 h組總體HA水平略高于1.5 h組；吸附2 h組相較其他兩組產(chǎn)生的HA滴度要略低。

表1 不同豬源H9N2亞型流感病毒濃度接種A549細(xì)胞后對細(xì)胞上清液HA滴度的影響Table 1 Effect of different H9N2 viral infection dose on its proliferation HA titer in A549 cell

表2 不同濃度胰酶維持液對豬源H9N2亞型流感病毒在A549細(xì)胞中增殖（HA滴度）的影響Table 2 Effect of different concentration of TPCK-Trypsin on H9N2 viral proliferation in A549 cell（HA titer）

2.5 培養(yǎng)液pH值對細(xì)胞上清液HA滴度的影響從表4可知，在培養(yǎng)時間為36 h時，5個組均產(chǎn)生了較低水平的HA滴度；在培養(yǎng)液pH7.5時，培養(yǎng)時間為72 h時HA滴度達(dá)到6.4log2，凍融后細(xì)胞上清液中HA滴度可達(dá)到最高值7.2log2；培養(yǎng)液pH7.2時，上清液的HA滴度僅略低于pH7.5組；pH值過高或過低都會對細(xì)胞上清液HA滴度有影響。

表3 不同吸附時間對豬源H9N2亞型流感病毒在A549細(xì)胞中增殖（HA滴度）的影響Table 3 Effect of different adsorption time on virus proliferation in A549 cell（HA titer）

表4 不同pH值培養(yǎng)液對豬源H9N2亞型流感病毒在A549細(xì)胞中增殖（HA滴度）的影響Table 4 Effects of different pH culture medium on the proliferation (HA titer) of H9N2 subtype SIV in A549

3 討論

相較于H5和H7等高致病性禽流感，H9N2屬于低致病性流感病毒，因此需要胰蛋白酶幫助裂解血凝素（HA）以使病毒更好的附著于細(xì)胞表面受體，從而完成病毒復(fù)制，故在本實驗中需加入胰蛋白酶幫助H9N2感染復(fù)制。若胰酶濃度偏低，則不能在病毒復(fù)制過程中起到幫助作用；而胰酶濃度過高，會影響細(xì)胞的生長狀態(tài)，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞變圓、破碎。本實驗針對細(xì)胞對胰蛋白酶的最佳耐受濃度進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞對胰酶較為敏感，其最佳胰酶耐受濃度為1 μg/mL，而本課題組之前相同處理的PMVEC耐受性要略低于A549，為0.6 μg/mL[14]；相同處理的MDCK對胰酶耐受性則高于A549，可達(dá)2.0 μg/mL。

本研究也對病毒感染時細(xì)胞維持液中胰蛋白酶的最佳濃度進(jìn)行篩選，使用10-2的病毒濃度感染細(xì)胞，維持液胰酶濃度為0.3 μg/mL時A549細(xì)胞的生長狀態(tài)及細(xì)胞上清液HA滴度最好。這與本課題組前期進(jìn)行的研究中，豬源H9N2亞型流感病毒在PMVEC細(xì)胞中最佳胰酶維持液濃度相同。馮婷等[15]報道H1N1病毒在MDCK細(xì)胞中增殖的最佳胰酶濃度為0.25 μg/mL。陳潤莉等[16]發(fā)現(xiàn)H1N1和H3N2病毒在MDCK細(xì)胞中增殖的最佳胰酶濃度為2.5～5.0 μg/mL病毒血凝價最高。史愛華等[17]研究H9N2亞型禽流感病在MDCK細(xì)胞中最佳增殖條件時使用10.0 μg/mL胰酶維持液。這可能是由于不同種類的細(xì)胞對胰酶的耐受度不同導(dǎo)致。

病毒稀釋倍數(shù)對病毒復(fù)制的影響，本研究發(fā)現(xiàn)不同稀釋倍數(shù)的病毒感染A549細(xì)胞在培養(yǎng)時間24 h內(nèi)均無血凝價，在培養(yǎng)時間為36 h時10-1和10-2出現(xiàn)HA滴度，并在72 h時HA滴度達(dá)到高峰。李春艷等[18]發(fā)現(xiàn)H9N2在MDCK細(xì)胞中的培養(yǎng)時間為48 h時出現(xiàn)HA滴度，并在72 h時達(dá)高峰，與本研究結(jié)果趨勢相同。在本課題組之前的H9N2對PMVEC及MDCK細(xì)胞的增殖影響試驗中發(fā)現(xiàn)，10-7稀釋的豬源H9N2亞型流感病毒在MDCK細(xì)胞也可增殖，其HA滴度仍達(dá)到7.8log2，豬源H9N2亞型流感病毒在PMVEC細(xì)胞[14]中增殖的最佳病毒稀釋度與A549細(xì)胞一致，HA滴度可達(dá)6.8log2。MDCK細(xì)胞常被作為流感病毒擴(kuò)增用的細(xì)胞，故A549細(xì)胞對流感病毒的易感性相較于MDCK細(xì)胞略低。

吸附時間對病毒增殖影響的試驗中發(fā)現(xiàn)，豬源H9N2感染A549細(xì)胞時病毒吸附1 h時效果最好。史愛華等[19]利用3株H9N2感染MDCK細(xì)胞試驗時發(fā)現(xiàn)采用1 h吸附，其病毒HA效價達(dá)到6log2。而在本課題研究豬源H9N2亞型流感病毒感染PMVEC試驗中發(fā)現(xiàn)2 h吸附效果最好。吸附時間高于2 h時對病毒增殖并無影響。

培養(yǎng)液pH值對病毒在A549細(xì)胞中擴(kuò)增的影響中試驗，發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)液pH值為7.5時病毒增殖效果最好。這與李春燕等[18]發(fā)現(xiàn)的H9N2禽流感病毒在MDCK細(xì)胞中擴(kuò)增的最佳培養(yǎng)液pH值為7.4，細(xì)胞上清液HA最高滴度為9log2的研究結(jié)果相同。

本研究顯示，盡管豬源H9N2亞型流感病毒對A549細(xì)胞感染能力較低，但其仍可以感染A549細(xì)胞，試驗確定其最佳增殖條件為病毒稀釋度為10-2，胰酶維持液濃度為0.3 μg/mL、病毒吸附時間1 h、培養(yǎng)液pH值為7.5。