張躍東，羅 薇，任玉鵬，張煥容，楊勁松，王 斌，葛潤洲

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041）

大腸桿菌（Escherichia coli）是人類和其他動(dòng)物腸道菌群組成的一部分[1]，因?yàn)榫邆湔{(diào)節(jié)腸道生態(tài)平衡、維生素合成及生物拮抗等功能，一度被認(rèn)為是腸道健康菌群，直到20世紀(jì)中葉，才發(fā)現(xiàn)部分大腸桿菌具有較強(qiáng)的致病性，此類大腸桿菌有特殊的血清型。致病性大腸桿菌可通過污染的水源、食物、用具等經(jīng)消化道、呼吸道以及皮膚開口和黏膜等造成機(jī)體感染，引起包括大腸桿菌性敗血癥、腹瀉、氣囊炎、肉芽腫、蜂窩織炎等病癥，主要危害年幼者[2-3]。

目前已確認(rèn)的大腸桿菌O抗原有196種[4]，O血清型中有162種與腹瀉有關(guān)，70多種與禽大腸桿菌病有關(guān)，以O(shè)1、O2、O8、O18、O35、O78、O88等常見[2,5]。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是一種危害兒童、旅行者及幼齡動(dòng)物的重要病原菌，為非侵入性胃腸感染，即黏膜感染[6]，可引起劇烈水樣腹瀉致使機(jī)體迅速脫水而死亡，即腸毒素（heat-labile toxin，LT）、耐熱性腸毒素（heat-stable enterotoxin，ST），通過激活腺苷酸環(huán)化酶和鳥苷酸環(huán)化酶引致腹瀉[7]。禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenicEscherichia coli，APEC）的稱謂主要源于獸醫(yī)界，許多APEC都屬于腸外致病性大腸桿菌，因缺乏深入的研究，其分類歸屬的致病型尚不清楚[2-3]。ETEC主要是人和哺乳動(dòng)物病原，對(duì)禽類致病的現(xiàn)象并不常見。有報(bào)道鴕鳥體內(nèi)分離獲得的APEC O15可表達(dá)STb，在腹瀉雛雞腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)有ETEC[2,8-9]，分離自鵪鶉體內(nèi)的致病性大腸桿菌可表達(dá)LT基因[10]。對(duì)鴨源致病性大腸桿菌毒力基因檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)鴨源致病性大腸桿菌攜帶ETEC黏附素F5基因，認(rèn)為是人和哺乳動(dòng)物ETEC所攜帶的黏附素基因[11-12]。2017年4月，四川省成都市某賽鴿公棚的賽鴿陸續(xù)發(fā)病、死亡，本研究自病、死賽鴿的肝臟分離出7株致病性大腸桿菌，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有6株分離菌攜帶黏附素F5基因、腸毒素基因sta、lt[11]，而黏附素、腸毒素普遍被認(rèn)為是ETEC的結(jié)構(gòu)；此6株分離菌中有3株血清型為O55[13]，血清型O55的致病性大腸桿菌與幼齡兒童腹瀉相關(guān)[2,14]，雖然禽的腸道有耐熱腸毒素的功能受體，但極少能從禽體內(nèi)分離出與人腹瀉病有關(guān)的大腸桿菌的血清型以及產(chǎn)生不耐熱和耐熱腸毒素的菌株[3]。為證實(shí)鴿源O55分離株是否真正表達(dá)了黏附素與腸毒素基因，并具備ETEC的特性，本研究選用黏附素凝集試驗(yàn)、兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)、乳鼠灌胃試驗(yàn)等經(jīng)典試驗(yàn)，確定其分類。以生物學(xué)試驗(yàn)中常用的哺乳動(dòng)物綱SPF級(jí)昆明鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，通過口服的途徑感染O55分離株，了解O55分離株對(duì)機(jī)體造成的病理損傷及抗原分布，為鴿源產(chǎn)腸毒大腸桿菌O55對(duì)哺乳動(dòng)物、人類的致病性研究提供實(shí)驗(yàn)參考，具有一定公共衛(wèi)生學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源2017年4月自四川省成都市某賽鴿公棚的病、死賽鴿肝臟分離出6株攜帶黏附素F5基因、腸毒素基因sta、lt的致病性大腸桿菌，此6株病原菌有3株血清型為O55[13]。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物3日齡SPF級(jí)昆明鼠乳鼠、20～22 g SPF級(jí)昆明鼠、2 kg新西蘭兔，均購自成都達(dá)碩試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.3 主要試劑及設(shè)備CaYE（致病性大腸埃希氏菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基）購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；F5陽性血清購自成都百盛科創(chuàng)生物科技有限公司；E.coliAntibody購自NOVUS；頭孢曲松鈉購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；透射電鏡（Tecnai F20）為美國FEI公司生產(chǎn)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（BA200 Digital）為麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

1.4 分離菌毒力基因檢測(cè)為了解6株分離菌其他毒力相關(guān)基因攜帶情況，參照文獻(xiàn)[15-16]的研究，選取與HPI毒力島、I型菌毛、P菌毛、鐵攝取系統(tǒng)、腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島、CoIV質(zhì)粒等相關(guān)的8對(duì)毒力基因引物進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以上毒力基因的反應(yīng)體系均為25 μL：PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s；X℃退火40 s；72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃反應(yīng)結(jié)束。X為擴(kuò)增不同毒力基因的退火溫度，其中擴(kuò)增毒力基因fyuA、fimC、papA、fimH退火溫度為50℃；擴(kuò)增tsh、eaeA、iss、irp-2的退火溫度為52℃。PCR反應(yīng)產(chǎn)物選用1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參考文獻(xiàn)[17]中關(guān)于細(xì)菌毒力基因克隆轉(zhuǎn)化的研究，對(duì)陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化，將鑒定結(jié)果為陽性的菌株，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與基因文庫中公布的序列進(jìn)行相似度比較，以確保檢測(cè)到相應(yīng)的基因。

表1 毒力基因引物序列Table 1 Primer information for each virulence gene

1.5 O55分離株菌毛電鏡觀察應(yīng)用2%磷鎢酸負(fù)染O55分離菌菌懸液，Tecnai F20型透射電鏡觀察并照相，該試驗(yàn)在四川大學(xué)望江校區(qū)分析測(cè)試中心完成。

1.6 O55分離株黏附素及腸毒素測(cè)定參考文獻(xiàn)[18-19]等研究，選用凝集試驗(yàn)和D-甘露糖抗性試驗(yàn)檢測(cè)黏附素F5；兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)、乳鼠灌胃試驗(yàn)檢測(cè)腸毒素。

1.7 O55分離株致病性觀察通過腹腔注射途徑測(cè)定O55分離株對(duì)SPF昆明鼠半數(shù)致死量（lethal dose 50%，LD50）。參考文獻(xiàn)[20]的研究，選用頭孢曲松鈉清除昆明鼠腸道菌群，以100LD50的劑量，口服感染昆明鼠，于感染后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、168 h分別采集感染鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸9個(gè)組織器官，固定并制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色及間接免疫酶組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1 分離菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果6株分離菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果：fimH與papA均為100%（6/6），fyuA為66.7%（4/6），eaeA與iss均為50%（3/6），irp-2、fimC與tsh均為33.3%（2/6），陽性樣本均擴(kuò)增出與目的片段大小相符的片段，測(cè)序得到的序列與基因文庫中公布的相應(yīng)毒力基因相似度均高，確保檢測(cè)到了相應(yīng)的毒力基因，PCR檢測(cè)毒力基因瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。提示分離菌具有較強(qiáng)的致病性?？ǚ綑z驗(yàn)顯示不同菌株之間毒力基因攜帶種類差異顯著（P<0.05）。選擇同期檢測(cè)攜帶毒力基因種類較多的O55分離株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 O55分離株菌毛電鏡觀察結(jié)果選擇同期檢測(cè)攜帶毒力基因種類較多的O55分離株進(jìn)行電鏡觀察，Tecnai F20透射電鏡下，可見菌體為桿菌，有紋理褶皺，形態(tài)似花生，周身長有大量密集的菌毛，有鞭毛（圖2、圖3）。

2.3 O55分離株黏附素及腸毒素測(cè)定結(jié)果O55分離株可引起F5陽性血清凝集，D-甘露糖抗血凝反應(yīng)結(jié)果顯示，O55分離株稀釋液接近1∶16時(shí)仍可引起3%雞紅細(xì)胞凝集。結(jié)合電鏡觀察結(jié)果與凝集試驗(yàn)結(jié)果，證明O55分離株具有菌毛黏附素F5。

圖1 6株分離菌毒力基因PCR檢測(cè)凝膠電泳圖Fig.1 PCR Amplification results of virulence gene

兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)結(jié)果顯示：O55分離株表現(xiàn)出其毒力（圖4），計(jì)算結(jié)扎腸段長度與腸內(nèi)液體比值，生理鹽水及CaYE培養(yǎng)基對(duì)照組小于1，表現(xiàn)為陰性；各腸毒素試驗(yàn)組結(jié)扎腸段長度與腸內(nèi)液體比值大于1，表現(xiàn)為陽性。證明O55分離株可表達(dá)熱敏腸毒素LT。

選用乳鼠灌胃試驗(yàn)測(cè)定ST：測(cè)定腸道及其內(nèi)容物與剩余體重比值，見表2。結(jié)果經(jīng)加熱處理的腸毒素液組（冷卻至室溫后再進(jìn)行試驗(yàn)）與未經(jīng)加熱處理的腸毒素液組的比值均大于0.085，為陽性，且經(jīng)加熱處理與未加熱處理的腸毒素液組之間，試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著（P>0.05），提示腸毒素液耐熱；CaYE對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組該比值均小于0.074，為陰性。結(jié)合腸毒素基因sta檢出，stb未檢出的結(jié)果，表明O55分離株可表達(dá)STa。

圖2 桿菌，周身布滿密集菌毛（×12 000）Fig.2 Bacilli with intensive pilus (×12 000)

圖3 桿菌，周身布滿密集菌毛（×20 000）Fig.3 Bacilli with intensive pilus (×20 000)

圖4 兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)測(cè)定熱敏腸毒素Fig.4 The rabbit intestinal-loop assays for detection of LT

2.4 致病性觀察結(jié)果經(jīng)Feiller精確矯正，95%的置信區(qū)間下，Bliss法[21]計(jì)算出的O55分離株對(duì)20 g左右SPF昆明鼠的LD50為1.66×105CFU/只。口服感染昆明鼠的活菌數(shù)為2.8×107CFU。感染后6 h，除脾臟外，試驗(yàn)鼠被檢器官組織均有損傷，隨時(shí)間推移，損傷有不同程度的加重，直至被觀察的168 h，其中肝臟、腎臟、肺臟、空腸和回腸的病變程度較為嚴(yán)重。各組織臟器部分時(shí)間點(diǎn)病理組織學(xué)觀察結(jié)果見圖5。心肌肌間血管擴(kuò)張、充血，肌纖維變性、壞死（圖5A）、炎性細(xì)胞浸潤；肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫性空泡變性、壞死（圖5B），炎性細(xì)胞浸潤，肝血竇擴(kuò)張、淤血，168 h肝組織內(nèi)有多個(gè)炎性細(xì)胞灶；感染后24～72 h脾小結(jié)增生、生發(fā)中心擴(kuò)張（圖5C），紅髓區(qū)脾血竇擴(kuò)張、充血，168 h有炎性細(xì)胞灶狀壞死；肺部呈現(xiàn)局域性的肺間隔增寬，間隔毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血（圖5D），炎性細(xì)胞浸潤，168 h肺泡腔、支氣管腔出現(xiàn)游離的紅細(xì)胞；腎臟感染初期，腎小球細(xì)胞增多，腎小囊腔變窄、消失，近曲小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔變窄、消失，部分管腔內(nèi)有粉紅色絮狀物，遠(yuǎn)曲小管管壁變薄，管腔變大，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血。被檢各腸段以空腸、回腸病變明顯，感染后6 h空腸腸絨毛刷狀緣有脫落，黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤，12 h腸絨毛斷裂脫落，固有層炎性細(xì)胞、紅細(xì)胞增多，24～168 h腸絨毛呈現(xiàn)水腫（圖5G）；回腸腸絨毛斷裂脫落（圖5H），黏膜下層血管擴(kuò)張充血，固有層血管充血、出血，炎性細(xì)胞浸潤，96～168 h腸腺萎縮，間質(zhì)增寬。

表2 乳鼠灌胃試驗(yàn)顯示的腸重與剩余體重比值結(jié)果Table 2 The ratios of intestinal weight and rest corpse weight of sucking mice

感染后6～168 h，試驗(yàn)昆明鼠的10個(gè)被檢部位持續(xù)檢測(cè)到O55抗原。陽性信號(hào)主要出現(xiàn)在心肌纖維的肌漿、胞漿（圖6A），肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)（圖6B），脾臟淋巴細(xì)胞間質(zhì)（圖6C），肺泡上皮細(xì)胞（圖6D），腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)（圖6E），十二指腸腸絨毛和腸腺上皮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)（圖6F），空腸、回腸腸絨毛上皮細(xì)胞、黏膜細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)（圖6-G～H），結(jié)腸腸黏膜上皮細(xì)胞及黏膜下層（圖6I）。

3 討論

致病性大腸桿菌具有特殊的血清型，玻片凝集法是用來檢測(cè)大腸桿菌臨床分離株血清型的傳統(tǒng)方法，因血清型眾多，K抗原能干擾O抗原凝集反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)需121℃高壓2 h破壞K抗原，此方法操作繁瑣，相對(duì)耗時(shí)長，費(fèi)用高，目前臨床醫(yī)學(xué)多選用檢測(cè)大腸桿菌攜帶的特定毒力基因判定其致病性[22]。本研究自2017年4月臨診大腸桿菌病病死賽鴿的肝臟中分離到6株致病性大腸桿菌，其中有3株血清型為O55，此6株分離菌均攜帶黏附素F5基因、腸毒素基因sta、lt[13]，此類基因是醫(yī)學(xué)上檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）的標(biāo)志性基因。ETEC主要是人和哺乳動(dòng)物病原，對(duì)禽類致病的現(xiàn)象并不常見。有報(bào)道：鴕鳥體內(nèi)分離獲得的APEC O15可表達(dá)STb，在腹瀉雛雞腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)有ETEC[2,8-9]，分離自鵪鶉體內(nèi)的致病性大腸桿菌可表達(dá)LT基因[10]；對(duì)鴨源致病性大腸桿菌毒力基因檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)鴨源致病性大腸桿菌攜帶ETEC黏附素F5基因，認(rèn)為是人和哺乳ETEC所攜帶的黏附素基因[11-12]。雖然禽的腸道有耐熱腸毒素的功能受體，卻極少能分離出與人腹瀉病有關(guān)的大腸桿菌血清型以及產(chǎn)生不耐熱和耐熱腸毒素的菌株[3]。根據(jù)前期對(duì)分離菌的生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到O55分離株攜帶黏附素F5基因、腸毒素基因sta、lt，屬于產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）的標(biāo)志性基因，有學(xué)者認(rèn)為，ETEC主要是人和哺乳動(dòng)物的病原，判定產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，在檢測(cè)到相應(yīng)標(biāo)志性基因的同時(shí)，還需要通過生物學(xué)試驗(yàn)證明分離株真正表達(dá)其毒力因子。為確定O55分離株是否為ETEC，采用黏附素凝集試驗(yàn)、D-甘露糖抵抗血凝試驗(yàn)、兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)、乳鼠灌胃試驗(yàn)，確定黏附素與腸毒素基因是否表達(dá)，結(jié)果顯示O55分離株能夠表達(dá)這些毒力因子，符合產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌的判定標(biāo)準(zhǔn)，為ETEC。

圖5 昆明鼠感染O55分離株病理學(xué)觀察Fig.5 Pathology observation of O55 isolate artificially infected Kunming mice

圖6 昆明鼠人工感染O55分離株抗原分布Fig.6 Distribution of positive signal of O55 isolate artificially infected Kunming mice

國內(nèi)外很多城市的居民和鴿子接觸比較多，根據(jù)比利時(shí)信鴿協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)，其國民平均每人擁有信鴿近千羽。緬甸仰光的街頭、悉尼的馬丁廣場(chǎng)以及我國濟(jì)南的泉城廣場(chǎng)等地，觀賞鴿較多，與人互動(dòng)親密，對(duì)人類健康的潛在危害也值得關(guān)注。本研究分離自鴿子肝臟的致病性大腸桿菌毒力基因攜帶情況為：fimH100%（6/6）、papA100%（6/6）、fyuA66.7%（4/6）、eaeA與iss均為50%（3/6）、irp-2、fimC與tsh均為33.3%（2/6）。papA基因是P菌毛的標(biāo)志性檢測(cè)基因[23]，P菌毛是定植于實(shí)質(zhì)臟器內(nèi)所必須的菌毛，引起敗血癥的大腸桿菌分離株中檢出率較高，多與人、狗及豬尿道大腸桿菌感染有關(guān)，導(dǎo)致急性腎盂腎炎[16]；fimH基因?yàn)镮型菌毛的D-甘露糖特異性黏附素，是細(xì)菌體外定植禽類呼吸道所必須的，可介導(dǎo)菌毛黏附于宿主細(xì)胞，結(jié)合I型菌毛檢測(cè)的標(biāo)志性基因fimC的檢出率（33.3%），表明分離菌中I型菌毛、P菌毛是廣泛存在的；eaeA是位于LEE毒力島上的基因，可介導(dǎo)細(xì)胞黏附于腸上皮細(xì)胞[3]；iss基因存在于CoIV質(zhì)粒上，多數(shù)可從禽致病性大腸桿菌中檢測(cè)到，編碼的蛋白Iss屬于外膜蛋白的一部分，可提高細(xì)菌毒力，是重要的致病因素[24]，tsh基因也是位于CoIV質(zhì)粒上的基因片段，與氣囊損傷有關(guān)，在禽致病性大腸桿菌中普遍存在，但在非致病性大腸桿菌中很少被檢出[3]，其編碼的Tsh蛋白可能與致病性大腸桿菌的鐵攝取能力相關(guān)，在感染早期有助于細(xì)菌定植在宿主呼吸道，可使細(xì)菌在低鐵環(huán)境中攝取鐵[15]；fyuA和irp-2是構(gòu)成HPI毒力島的重要基因，可作為檢測(cè)HPI是否存在的標(biāo)志[25]。HPI毒力島的檢出率與菌株的致病力呈明顯的正相關(guān)，可在耶爾森氏菌和大腸桿菌之間水平傳播[26]。資料顯示，APEC可能是人源大腸桿菌的毒力基因儲(chǔ)存庫，鴿也是大腸桿菌的天然儲(chǔ)存宿主[3,27-28]，APEC的毒力因子可水平轉(zhuǎn)移至與人類相關(guān)的致病性大腸桿菌上[3,29]。賽鴿在比賽時(shí)常遠(yuǎn)距離飛翔，經(jīng)過多個(gè)城市，通過糞便排出病原，其攜帶的毒力基因可對(duì)人類的健康造成潛在的危害，值得關(guān)注。

大腸桿菌通過粘膜定植或皮膚開口進(jìn)入宿主體內(nèi)。黏附定植決定于多種黏附因子，這些黏附因子有助于細(xì)菌與受體的結(jié)合以及隨后的繁殖。細(xì)菌在生長繁殖過程中合成能損害宿主，使機(jī)體發(fā)生病變、出現(xiàn)癥狀甚至死亡的毒性物質(zhì)[3]。內(nèi)毒素對(duì)組織無嚴(yán)格的選擇作用，可引起發(fā)熱，使血循環(huán)中的白細(xì)胞驟減，當(dāng)內(nèi)毒素進(jìn)入循環(huán)，損傷微循環(huán)血管上皮細(xì)胞，形成血栓，使有效循環(huán)血量減少，造成廣泛性、彌漫性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC），使組織缺血性壞死[2]。入血的內(nèi)毒素首先對(duì)肝臟造成損傷[30]，產(chǎn)生急性期蛋白、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）及白介素-6（IL-6）。光鏡下肝臟在感染6 h、96 h、120 h后出現(xiàn)大量肝細(xì)胞發(fā)生彌漫性空泡變性、炎細(xì)胞浸潤等損傷，肝臟小葉間中央靜脈周圍細(xì)胞的損傷程度相對(duì)較為嚴(yán)重，這可能與含有細(xì)菌的血液血流方向有一定的關(guān)系，確認(rèn)O55分離株可以造成試驗(yàn)鼠肝臟的嚴(yán)重?fù)p傷，影響其功能，造成保護(hù)防御功能減弱，加強(qiáng)細(xì)菌經(jīng)血液進(jìn)入其他臟器而造成的損傷[31]。從多器官組織切片觀察的結(jié)果來看，感染期間，試驗(yàn)鼠心臟、脾臟、肺臟、腎臟等實(shí)質(zhì)器官出現(xiàn)了程度不同的泛嗜性病變，如感染期間，腎小管間質(zhì)出現(xiàn)的粉紅色均染物質(zhì)，可作為機(jī)體蛋白尿的判定依據(jù)，脾臟的病變損傷會(huì)影響機(jī)體的免疫機(jī)能，此外內(nèi)毒素也會(huì)抑制巨噬細(xì)胞活性，有利于大腸桿菌的存活和擴(kuò)散[3]。本實(shí)驗(yàn)O55分離株對(duì)機(jī)體肝臟、肺臟、心臟、腎臟的損傷，與王景[19]對(duì)O24 ETEC分離株人工感染試驗(yàn)動(dòng)物的研究結(jié)果相似，但病變較之嚴(yán)重。本研究鴿源O55分離株可造成脾臟的損傷，與其實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果不一致，可能與病原的毒力、試驗(yàn)動(dòng)物的差異有關(guān)；與于學(xué)輝[16]報(bào)道的鴨致病性大腸桿菌引起的實(shí)質(zhì)臟器的損傷相似。

大腸桿菌在生長過程中合成分泌的外毒素，毒性較強(qiáng)，對(duì)組織器官有一定的選擇性，通過與靶器官的受體結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮作用。最為人所知的是ETEC所產(chǎn)生的，由質(zhì)粒編碼的ST與LT。LT可激活腸毛細(xì)血管上皮細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶，增加環(huán)腺苷酸產(chǎn)生，使腸粘膜細(xì)胞分泌亢進(jìn)，引起腹瀉；STa可激活回腸上皮細(xì)胞刷狀緣絨毛上的鳥苷酸環(huán)化酶，增加環(huán)鳥苷酸的產(chǎn)生，引起分泌性腹瀉。血清型O55的致病性大腸桿菌，其病原依靠黏附力，黏附于十二指腸道、空腸與回腸上段黏膜，破壞微絨毛刷狀緣，引起幼齡動(dòng)物、兒童腹瀉，甚至死亡，死亡率高[2]。本研究鴿源O55分離株具有黏附素F5，且表達(dá)腸毒素STa、LT；F5主要定植于宿主空腸和回腸[32]，STa的高分泌部位是空腸[33]，在光學(xué)顯微鏡下，感染鼠腸道各段均呈現(xiàn)腸絨毛及腸黏膜的損傷和炎癥反應(yīng)，以空腸和回腸損傷嚴(yán)重。十二指腸在感染后的12～96 h呈現(xiàn)出程度不同的輕微損傷，絨毛斷裂脫落，固有層炎性細(xì)胞增多；感染后12 h，空腸、回腸多處絨毛水腫，絨毛斷裂、脫落，固有層血管充血出血，炎性細(xì)胞浸潤，粘膜下層淋巴樣小結(jié)增生，96 h回腸腸腺萎縮，間質(zhì)增寬；感染后24～120 h的結(jié)腸黏膜下層出現(xiàn)粉紅色絮狀物及浸潤的炎性細(xì)胞?？漳c和回腸黏膜下層存在有豐富的淋巴集腺，當(dāng)病原入侵該區(qū)域時(shí)，此處非特異性免疫現(xiàn)象較為強(qiáng)烈，炎性細(xì)胞所釋放的致炎因子，一方面可殺傷入侵病原，另一方面也可造成該處組織細(xì)胞的損傷[31,34]，各段腸組織結(jié)構(gòu)的損傷，不僅影響食物的消化吸收，造成營養(yǎng)不良，也有助于腸致病菌穿越損傷的腸粘膜，并在宿主機(jī)體的內(nèi)環(huán)境存活下來[3]。與王景[19]的研究相比，分離菌對(duì)機(jī)體空腸、回腸的損傷相符，符合產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的致病特性，但本實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物腸道的炎性反應(yīng)更為劇烈，絨毛水腫和絨毛損傷更為嚴(yán)重，可能與O55血清型有關(guān)。

本研究分離得到的6株攜帶黏附素F5基因，腸毒素基因sta、lt的鴿源致病性大腸桿菌株毒力基因檢測(cè)結(jié)果為fimH與papA均為100%（6/6），fyuA66.7%（4/6），eaeA與iss均為50%（3/6），irp-2、fimC與tsh均為33.3%（2/6），提示分離菌具有較強(qiáng)的致病性。O55分離株表達(dá)了黏附素F5，產(chǎn)生腸毒素STa、LT，符合產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的判定標(biāo)準(zhǔn)。鴿源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌O55分離株對(duì)試驗(yàn)鼠有致病性，可造成小鼠多個(gè)臟器的持續(xù)性損傷，以肝臟、肺臟、腎臟、空腸、回腸較為嚴(yán)重，抗原主要位于感染部位細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞間質(zhì)。