朱利塞，賈愛(ài)卿，王貴平，李 菲，王 娟，鄧勝朝，錢雪橋

（1.廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心 海大中央研究院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州511400；2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州 511400）

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，感染的豬只主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和食欲下降等[1-2]。1970年，豬流行性腹瀉最早在歐洲出現(xiàn)，隨后相繼在中國(guó)、加拿大、美國(guó)等國(guó)家暴發(fā)。1984年，王斌等[3-4]首次應(yīng)用胎豬腸上皮細(xì)胞分離到豬流行性腹瀉病毒，該病毒可感染各年齡段的豬，7日齡內(nèi)的哺乳仔豬最為易感，死亡率高達(dá)80%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重威脅。

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒的基因組約為28 kb，5'端包含帽子結(jié)構(gòu)，3'端包含一個(gè)多聚腺苷酸尾巴（PolyA）。病毒基因組包括7個(gè)ORFs，分別編碼復(fù)制酶（1a、1b）、纖突蛋白（S）、ORF3蛋白、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），其中S蛋白是位于病毒表面的重要糖蛋白，能促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的融合，刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體等作用[5-6]。S蛋白由S1（1～789 aa）和S2（790～1383 aa）兩個(gè)亞基組成[7-9]，S1蛋白的COE區(qū)域（499～638 aa）是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，同時(shí)，也有研究證明S2的N端具有中和表位[10-11]。S1蛋白的COE區(qū)和S2蛋白的N端在不同基因型的PEDV毒株間相對(duì)保守，是較好的PEDV疫苗候選抗原。本研究首先利用融合PCR的方法將S1蛋白的COE區(qū)與S2蛋白的N端連接，然后利用pET32a原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)S1與S2的融合蛋白、S1蛋白的COE區(qū)及S2蛋白的N端，并對(duì)這3種蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫原性分析，為PEDV亞單位疫苗的研制及抗體檢測(cè)方法的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞、血清CHYJ130330 PEDV分離株為實(shí)驗(yàn)室分離保存，豬抗PEDV的陽(yáng)性血清為本實(shí)驗(yàn)室制備，Vero細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司，pMD18-T載體、TaqDNA聚合酶、BamH I和SalI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬的IgG購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)本實(shí)驗(yàn)分離株CHYJ130330的基因組序列，設(shè)計(jì)3對(duì)表達(dá)引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PEDV S基因的引物Table 1 Primers used for amplification of the S gene

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增將PEDV分離株CHYJ130330接種Vero細(xì)胞，待出現(xiàn)典型的CPE后，吸取病毒的上清液進(jìn)行RNA的提取，RNA的提取方法按照Omega公司的RNA提取試劑盒進(jìn)行。cDNA的合成按照（TOYOBO）的試劑盒進(jìn)行，即10 μL的反應(yīng)體系中加入2 μg的總RNA，特異性下游引物1 μL（20 μmol/L），反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，0.5 μL RNA抑制劑（40 U/μL），ddH2O補(bǔ)加至10 μL，混合后42℃反應(yīng)1 h，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR的擴(kuò)增以高保真的DNA聚合酶進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸100 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增的條帶用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。

1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增正確的目的條帶分別利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化后的目的基因分別克隆至pMD18-T載體上，通過(guò)PCR和測(cè)序方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒雙酶切后克隆至pET32a原核表達(dá)載體上，通過(guò)PCR和酶切驗(yàn)證篩選出陽(yáng)性質(zhì)粒，分別命名為pET32a-S1、pET32a-S2及pET32a-2S，并送測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 蛋白的表達(dá)與Western blot分析將測(cè)序正確的pET32a-S1、pET32a-S2及pET32a-2S分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）細(xì)胞中，挑取單克隆于37℃搖床培養(yǎng)，當(dāng)D600值為0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)SDS-PAGE對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行鑒定，純化重組蛋白。應(yīng)用Western blot對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行鑒定，以豬抗PEDV的陽(yáng)性血清為一抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗豬的IgG。

1.7 重組蛋白的免疫原性鑒定將純化后的重組蛋白分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按1∶1混合乳化，按照免疫程序免疫小鼠，每只小鼠的免疫劑量為50 μg，每次的免疫時(shí)間間隔為14 d，經(jīng)3次免疫后分別收集血清。通過(guò)包被PEDV全病毒及優(yōu)化ELISA的條件建立檢測(cè)PEDV抗體的方法，并應(yīng)用該方法分別對(duì)3種蛋白免疫前和3免后的血清效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，比較分析3種蛋白所產(chǎn)生的抗體效價(jià)的高低。

2 結(jié)果

2.1 S1、S2及2S基因的擴(kuò)增以CHYJ130330毒株的cDNA為模板，分別擴(kuò)增S1的COE區(qū)、S2的N端及S1和S2的串聯(lián)基因，擴(kuò)增的條帶經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1，目的條帶大小與預(yù)期相符，分別為729 bp、525 bp和1254 bp。

2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建將S1、S2及2S基因純化后克隆至pMD18-T載體上，用BamH I/SalI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，目的條帶大小與預(yù)期相符，結(jié)果見(jiàn)圖2。將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-S1、pMD18-T-S2及pMD18-T-2S分別用BamH I/SalI雙酶切后，將目的基因克隆至pET32a原核表達(dá)載體上，重組質(zhì)粒分別命名為pET32a-S1、pET32a-S2及pET32a-2S，雙酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 S1、S2及2S基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of S1, S2 and 2S gene

2.3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定將上述原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）細(xì)胞中，加入IPTG，16℃條件下誘導(dǎo)20 h后收集菌體，與未誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)組的細(xì)菌均表達(dá)出與預(yù)期大小相符的重組蛋白，S1、S2及2S蛋白大小分別為26 kDa、20 kDa及46 kDa，由于pET32a載體的標(biāo)簽蛋白的大小為19 kDa，所以融合蛋白的大小分別為45 kDa、40 kDa及65 kDa，結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)蛋白均與陽(yáng)性的豬抗PEDV的抗血清發(fā)生反應(yīng)（圖5），表明重組蛋白表達(dá)正確。

2.4 重組蛋白的純化表達(dá)結(jié)果顯示，3個(gè)重組蛋白均為非可溶性蛋白，同時(shí)將3個(gè)重組蛋白分別使用Ni柱進(jìn)行純化，純化后的目的蛋白條帶單一，純化效果較好，結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.5 S1、S2及2S重組蛋白免疫原性鑒定應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室已建立的ELISA方法，分別對(duì)S1、S2及2S重組蛋白3免后采集的小鼠血清和陰性血清效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，3種血清的效價(jià)分別為1∶3200、1∶3200及1∶4800，說(shuō)明3種重組蛋白均具有一定的免疫原性，且串聯(lián)表達(dá)的重組蛋白2S產(chǎn)生的抗體效價(jià)最高，說(shuō)明其免疫原性強(qiáng)于重組蛋白S1和S2。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-S1、pMD18-T-S2 及pMD18-T-2S的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of pMD18-T-S1, pMD18-T-S2 and pMD18-T-2S plasmid by double digestion

圖3 原核表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of prokaryotic expression plasmid by double digestion

3 討論

近年來(lái)，PEDV在我國(guó)不斷暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，疫苗免疫和及時(shí)診斷是預(yù)防和控制該病的有效措施。S蛋白是位于病毒表面的纖突蛋白，不但能介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞，而且能刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體[12-13]。因此，無(wú)論是PEDV亞單位疫苗的研究還是PEDV檢測(cè)方法的建立，大多數(shù)首選S蛋白作為靶蛋白。有研究證實(shí)，串聯(lián)的抗原表位可以增強(qiáng)抗原的免疫原性，所以本研究選擇S1的COE區(qū)、S2的N端為研究對(duì)象，將S1的COE區(qū)和S2的N端串聯(lián)共表達(dá)，比較分析3個(gè)蛋白的免疫原性。

pET表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白表達(dá)量高、穩(wěn)定性較好、蛋白易于純化等優(yōu)點(diǎn)，所以本研究選擇pET32a原核表達(dá)載體進(jìn)行目的蛋白的融合表達(dá)，在誘導(dǎo)時(shí)摸索重組蛋白的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑的濃度等條件，最后確定這3個(gè)目的蛋白在誘導(dǎo)溫度為20℃，誘導(dǎo)時(shí)間為24 h，IPTG濃度為1.0 mmol/L時(shí)表達(dá)量較高。通過(guò)Western blot 分析顯示，3個(gè)蛋白均能與PEDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，而不與pET32a空載體發(fā)生反應(yīng)，將3個(gè)蛋白純化后分別免疫小鼠制備多克隆抗體，3免后免疫重組蛋白2S小鼠的血清效價(jià)高于免疫重組蛋白S1和S2小鼠的血清效價(jià)，充分說(shuō)明了2S重組蛋白具有良好的免疫原性，為后續(xù)的基因工程亞單位疫苗研制提供了有力參考。且與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗具有安全、價(jià)廉、多價(jià)、易于儲(chǔ)存運(yùn)輸、具有較好的靶攻擊性等優(yōu)點(diǎn)，是疫苗發(fā)展的理想方向。

圖4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig.4 Results of expression of recombinant proteins

圖5 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blot identification of recombinant protein

圖6 重組蛋白的純化Fig.6 Purification of recombinant protein