朱明旺,王繼華,高華峰,劉紹陽,彭正啓,信愛國
(1.云南省獸醫(yī)生物制品研制中心,保山 678000;2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 國家口蹄疫專業(yè)實驗室(昆明),昆明650224;3.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點(diǎn)實驗室,昆明 650224)
口蹄疫(foot-and-mouth,F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,F(xiàn)MDV)引起,侵襲豬、牛、羊等偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播速度快、流行范圍廣,病毒可通過接觸易感動物和空氣傳播,易感動物接觸病毒后2~3 d產(chǎn)生臨床癥狀,并能夠持續(xù)7~10 d,發(fā)病率為100%,幼畜經(jīng)常不見癥狀而猝死,死亡率因病毒株而異,嚴(yán)重時可達(dá)100%。FMDV目前已知有7個不同的血清型(A、O、C、Asia 1和南非1、2、3型),在每個血清型內(nèi)存在多種亞型,不同血清型間無交叉免疫性。FMD流行具有明顯的地域性[1],Asia 1型FMD是第7個被確認(rèn)的血清型[2],目前主要流行于南亞及東南亞地區(qū)[3-4]。
1958年4月云南省保山地區(qū)發(fā)生疑似FMD疫情,從病樣中分離到1株FMDV,命名為中國保山型,簡稱“中保型(ZB型)”[5]。1980年代,采用來源于世界FMD參考實驗室(WRLFMD,英國Pirbright實驗室)的標(biāo)準(zhǔn)血清,確定云南分離ZB型FMDV為“Asia 1”型[5-6]。1958年底,研究者開始將ZB野生強(qiáng)毒株接種3~5日齡乳兔進(jìn)行繼代培育,研發(fā)FMD兔化弱毒疫苗。病毒傳至第50代、64代,回歸牛體致病明顯;傳至第109代,回歸牛體毒力減弱,114代減毒株于健康牛舌面粘膜穿刺接種,進(jìn)行牛體安全試驗,證明只有極少數(shù)牛在舌面注射部位發(fā)生少量原發(fā)性小水皰,不產(chǎn)生二期水皰;同居牛不感染;回歸牛體繼代4~6代不增強(qiáng)其致病力(賴天才:口蹄疫Asia 1型兔化毒的研究,1981年,內(nèi)部資料)。結(jié)果獲得了ZB株(血毒系)致弱毒株,其致病力和免疫原性達(dá)到口蹄疫弱毒疫苗的標(biāo)準(zhǔn)。該弱毒疫苗是采集發(fā)病乳兔肌肉和臟器,研磨后用pH7.6的磷酸鹽緩沖液稀釋至1%,取1 mL接種牛體,可以產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果,免疫持續(xù)期可達(dá)半年以上,1960-1980年曾用于云南省瀾滄江以西地區(qū)Asia 1型口蹄疫的免疫防治(內(nèi)部資料)。
由于FMD常規(guī)減毒活疫苗在使用過程中發(fā)現(xiàn)在假定宿主內(nèi)致弱的毒株對別的易感宿主具有致病性,存在弱毒疫苗株毒力返祖風(fēng)險[7-8]。減毒疫苗在使用過程中仍然具有潛在的回復(fù)突變可能性,因此該兔化弱毒疫苗株ZBatt現(xiàn)已停止使用。比較ZBatt與其親本強(qiáng)毒株的生物學(xué)特性差異,可為深入研究ZBatt株減毒致弱機(jī)理提供毒力評價依據(jù)。本研究測定了ZBatt株和其親本強(qiáng)毒株感染不同來源的細(xì)胞的病變效應(yīng),病毒對乳鼠、豚鼠的致病情況,比較了強(qiáng)毒株和弱毒株分別感染宿主細(xì)胞后幾個宿主因子mRNA表達(dá)差異,分析ZB強(qiáng)毒株和弱毒株的部分生物學(xué)表型差異,為評價病毒毒力差異的替代模型提供依據(jù)。
1.1 病毒株、細(xì)胞株、實驗動物口蹄疫亞洲1型細(xì)胞組織培養(yǎng)弱毒ZB/CHA/58(att)(簡稱ZBatt)(GenBank登錄號:DQ533483)[5],由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院保存,系本室保存的“ZB”型兔化弱毒ZBRF187代適應(yīng)BHK-21細(xì)胞后保存?zhèn)溆茫粡?qiáng)毒株ZBCF222系牛舌皮組織毒適應(yīng)BHK-21細(xì)胞3代備用,由云南省獸醫(yī)生物制品研制中心(原口蹄疫保山疫苗廠)保存[9];BHK-21細(xì)胞為本實驗室細(xì)胞庫凍存;牛原代腎細(xì)胞和睪丸細(xì)胞由課題組制備;試驗用乳鼠和豚鼠由云南省獸醫(yī)生物制品研制中心提供。
1.2 病毒對不同細(xì)胞的敏感性比較將弱毒株ZBatt和強(qiáng)毒株ZBCF222分別接種3種傳代細(xì)胞系(BHK-21、IBRS-2和PK)和牛原代腎(BK)細(xì)胞、牛原代睪丸(BT)細(xì)胞,觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)。
1.3 病毒對不同細(xì)胞的蝕斑形態(tài)比較將弱毒株ZBatt和強(qiáng)毒株ZBCF222稀釋成10-3、10-4、10-5,取0.2 mL分別接種于長滿單層BHK-21和BK細(xì)胞的24孔培養(yǎng)基中,每個稀釋度接種2孔,吸附1 h。將4×MEM與1.5%甲基纖維素以1:3的比例混合后加入2%血清和雙抗,充分混合配制病毒蝕斑覆蓋層,按照1 mL/孔加入到細(xì)胞板中。37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察;48 h后,吸棄培養(yǎng)基中覆蓋液后加入結(jié)晶紫染色液500 μL/孔染色,室溫靜置30 min,洗去培養(yǎng)基中染色液,室溫干燥,觀察蝕斑結(jié)果。
1.4 病毒生長曲線測定首先測定弱毒株ZBatt和強(qiáng)毒株ZBCF222的TCID50備用。分別將病毒稀釋成100TCID50/0.1 mL,各取0.2 mL分別接種12孔板中長滿單層BHK-21細(xì)胞和BK細(xì)胞,每個稀釋度接種3孔。在接種后預(yù)定的時間點(diǎn)分別收獲病毒,測定其TCID50,繪制病毒生長曲線。
1.5 病毒對乳鼠的生存曲線測定將ZBatt株和株ZBCF222分別稀釋為1TCID50/0.1 mL、0.1TCID50/0.1 mL和0.01TCID50/0.1 mL。選用3日齡乳鼠,隨機(jī)分為3組,每組8只,按200 μL/只依次接種3個稀釋度的病毒,注射后連續(xù)觀察7 d;記錄每組乳鼠的死亡數(shù)量和死亡時間,繪制乳鼠生存曲線。
1.6 病毒對豚鼠致病性觀察按照常規(guī)方法分別測定弱毒株ZBCF222和強(qiáng)毒ZBatt株的乳鼠LD50。分別用500LD50和1000LD50劑量,每只豚鼠在左后腳趾部皮內(nèi)接種0.2 mL病毒液,逐日觀察豚鼠發(fā)病情況,記錄結(jié)果。
1.7 病毒感染BK細(xì)胞宿主因子mRNA相對表達(dá)量測定研究表明,野生型FMDV毒株和L蛋白缺失減毒株感染牛源宿主細(xì)胞后,誘導(dǎo)宿主天然免疫反應(yīng)差異基因表達(dá)上調(diào),主要與干擾素誘導(dǎo)基因、趨化因子和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)[10]。據(jù)此,ZB強(qiáng)毒株和弱毒株感染BK細(xì)胞后,選擇測定與之相關(guān)的CCL2、IFN-β、ISG15、Mx1、OAS和PKR宿主因子相對定量表達(dá)水平,用于解析可能與ZB病毒致弱相關(guān)的宿主因子和信號通路。擴(kuò)增ZB株3D基因片段的熒光定量引物[11]和6種宿主因子熒光定量引物[10]信息詳見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。分別取0.2 mL 100TCID50/0.1 mL的強(qiáng)毒株ZBCF222和弱毒株ZBatt接種12孔板中長滿單層的牛原代腎(BK)細(xì)胞,每個稀釋度接種2孔。在接種后第12 h和24 h分別收獲病毒,測定病毒RNA的相對復(fù)制量和6種細(xì)胞宿主因子的mRNA相對表達(dá)量。試驗獨(dú)立重復(fù)2次。
1.8 實驗數(shù)據(jù)處理分析實驗數(shù)據(jù)以x±SD表示, 經(jīng)統(tǒng)計軟件Graphad Prism(Version 5.01)處理分析和圖像呈現(xiàn)。采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析,P<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 病毒感染不同細(xì)胞系的敏感性比較兔化弱毒株ZBatt和野生強(qiáng)毒株ZBCF222分別接種BHK-21細(xì)胞,經(jīng)24 h培養(yǎng)觀察,光鏡下均可看到有點(diǎn)狀細(xì)胞脫落、細(xì)胞變圓和核濃縮等現(xiàn)象,細(xì)胞產(chǎn)生典型的CPE。感染IBRS-2和PK細(xì)胞后,培養(yǎng)72 h均未見明顯的CPE,只是有一些不規(guī)則、散在的圓形細(xì)胞浮在正常細(xì)胞的上面;盲傳至第3代也沒有出現(xiàn)CPE,表明IBRS-2和PK細(xì)胞對ZB病毒感染不敏感。ZBatt株和ZBCF222株分別感染牛原代BK細(xì)胞和牛原代BT細(xì)胞,72 h后觀察到強(qiáng)毒株ZBCF222感染能夠?qū)е录?xì)胞產(chǎn)生CPE,而弱毒株ZBatt感染則不能產(chǎn)生CPE,表明ZBCF222對天然宿主來源細(xì)胞具有致病性,而ZBatt則呈現(xiàn)減毒表型。本研究在體外培養(yǎng)細(xì)胞上證實使用ZBatt減毒株制備弱毒疫苗的可靠性(圖略)。
2.2 病毒感染不同細(xì)胞的蝕斑形態(tài)比較觀察比較兔化弱毒株ZBatt和強(qiáng)毒株ZBCF222病毒在BHK-21細(xì)胞和BK細(xì)胞中的蝕斑形態(tài),結(jié)果顯示二者在BHK-21細(xì)胞上均可產(chǎn)生明顯的CPE,形成大小相似的蝕斑;而在牛原代腎細(xì)胞上,強(qiáng)毒株ZBCF222病毒可以產(chǎn)生明顯的蝕斑,而弱毒株ZBatt病毒則無明顯的蝕斑形成(圖1),表明ZBCF222病毒感染牛原代細(xì)胞,而減毒株ZBatt對牛源細(xì)胞不具有感染性。
2.3 病毒對乳鼠及豚鼠的致病性試驗結(jié)果按照常規(guī)方法,分別將ZBCF222和ZBatt病毒接種3~5日齡乳鼠,測定的其半數(shù)致死量(median lethal dose,LD50)。結(jié)果ZBCF222和ZBatt的LD50分別為10-7.3/0.2 mL和10-9.0/0.2 mL。
表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study
圖1 ZBatt株和ZBCF222株感染BHK-21和牛原代腎細(xì)胞(BK)蝕斑形態(tài)比較Fig.1 Plaque morphology of the ZBatt and ZBCF222 strain in BHK-21 or BK cells
將ZBatt和ZBCF222分別接種乳鼠,測定病毒對乳鼠的生存曲線。結(jié)果顯示,1TCID50/0.1 mL高劑量組接種乳鼠24 h后,乳鼠出現(xiàn)典型的呼吸困難、后肢麻痹等癥狀,開始出現(xiàn)死亡,ZBatt在接種36 h致乳鼠全部死亡,ZBCF222在接種48 h后致乳鼠全部死亡(圖2A);ZBatt對乳鼠的致病性強(qiáng)于ZBCF222(P<0.05)。中劑量組(0.1TCID50/0.1 mL),ZBatt 36 h后乳鼠有死亡,48 h全部死亡;而ZBCF222至7 d觀察結(jié)束時乳鼠的生存率為70%,ZBatt對乳鼠的致病力顯著強(qiáng)于ZBCF222(P<0.001)(圖2B);低劑量組(0.01TCID50/0.1 mL),7 d試驗觀察期內(nèi)乳鼠全部健活,二者無差別(圖略)。結(jié)果表明兔化弱毒株ZBatt對乳鼠的致病性高于野生型強(qiáng)毒株ZBCF222。
利用豚鼠作為小動物試驗?zāi)P停容^ZBCF222和ZBatt的毒力差異。結(jié)果表明,低劑量500LD50/0.2 mL組,ZBCF222接種豚鼠后2~3 d發(fā)病,觀察到豚鼠精神萎糜,不愿活動,食欲減少或廢絕,口角污穢不潔,流涎,產(chǎn)生繼發(fā)感染,趾部產(chǎn)生繼發(fā)水皰,皮膚脫離(圖3),發(fā)病率20%;ZBatt接種豚鼠均無明顯臨床癥狀出現(xiàn)。高劑量組(1000LD50/0.2 mL),接種ZBCF222后,豚鼠出現(xiàn)典型的臨床癥狀,產(chǎn)生嚴(yán)重的繼發(fā)感染,發(fā)病率為100%;接種ZBatt后豚鼠不表現(xiàn)臨床癥狀(表2)。結(jié)果表明野生型強(qiáng)毒株ZBCF222對豚鼠具有強(qiáng)的致病性,兔化弱毒株ZBatt對豚鼠呈現(xiàn)減毒表型。結(jié)果與ZBCF222和ZBatt對牛體的致病表現(xiàn)具有一致性,判斷豚鼠可作為ZB強(qiáng)毒株和弱毒株的毒力差異比較的試驗動物。
圖2 強(qiáng)毒株ZBCF222和弱毒株ZBatt接種乳鼠存活率比較結(jié)果Fig.2 Survival rate of suckling mice after challenge of ZBCF222(A) and ZBatt(B)
圖3 弱毒株ZBatt(A)和強(qiáng)毒株ZBCF222(B)接種豚鼠發(fā)病圖Fig.3 Pathological map of guinea pig inoculated with attenuated ZBatt(A) and virulent ZBCF222 strain(B)
2.4 病毒生長曲線測定結(jié)果ZBatt和ZBCF222的病毒效價分別為10-6.0TCID50/0.1 mL和10-5.8TCID50/0.1 mL。分別將病毒稀釋成100TCID50/0.1 mL,接種BHK-21和BK細(xì)胞,在預(yù)定時間點(diǎn)收獲病毒,測定其TCID50,繪制病毒生長曲線。結(jié)果顯示ZBCF222和ZBatt在BHK-21細(xì)胞上具有相似的增殖特性(圖4A)。ZBCF222感染BK細(xì)胞后,病毒能夠增殖復(fù)制至36 h,效價為10-5.5TCID50/0.1 mL;而ZBatt感染BK細(xì)胞后,病毒不增殖,兔化弱毒株ZBatt和野生強(qiáng)毒株ZBCF222在BK細(xì)胞上的病毒增殖特性差異顯著(P=0.008)(圖4B)。
2.5 病毒感染BK細(xì)胞誘導(dǎo)宿主因子mRNA相對定量結(jié)果將ZBCF222和ZBatt感染BK細(xì)胞后,分別收獲12 h和24 h病毒液,測定病毒RNA復(fù)制量及細(xì)胞中宿主因子mRNA相對表達(dá)量,結(jié)果見圖5。ZBCF222和ZBatt感染BK細(xì)胞后,6種宿主因子CCL2、IFN-β、ISG15、Mx1、OAS和PKR的相對表達(dá)變化差異均不明顯,表明ZB株強(qiáng)弱病毒與宿主相互作用對這6個宿主因子影響不顯著。病毒感染BK細(xì)胞后,ZBCF222病毒RNA復(fù)制量(P=0.004)高于ZBatt病毒RNA復(fù)制量,差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明,ZBCF222能夠在天然來源宿主細(xì)胞中復(fù)制,而ZBatt復(fù)制效率差,這種復(fù)制效率差異與選擇測定的6種宿主因子mRNA相對定量表達(dá)水平不相關(guān)。
表2 ZB強(qiáng)弱毒株接種豚鼠試驗結(jié)果Table 2 The results of injection virulent or attenuated ZB viruses in guinea pigs
本研究比較了亞洲1型FMD兔化弱毒疫苗株ZBatt和其親本強(qiáng)毒株ZBCF222的部分生物學(xué)特性。結(jié)果顯示,二者感染BHK-21后具有相似的致病性、病毒復(fù)制和RNA增殖特性,形成蝕斑形態(tài)大小相似,并且二者均對IBRS-2和PK細(xì)胞不敏感。但強(qiáng)毒和弱毒感染天然宿主來源的原代細(xì)胞則存在明顯的致病性差異,強(qiáng)毒株能導(dǎo)致BK細(xì)胞產(chǎn)生典型細(xì)胞病變,形成明顯可見蝕斑形態(tài),病毒生長曲線和RNA復(fù)制效率測定也證明這一特性;而兔化弱毒株感染BK細(xì)胞不產(chǎn)生CPE,也不產(chǎn)生明顯可見的蝕斑形態(tài),病毒增殖效果不明顯。結(jié)果表明,兔化弱毒株ZBatt對天然宿主細(xì)胞呈現(xiàn)減毒特征,在細(xì)胞水平上證明其作為減毒活疫苗使用的安全性。
圖5 ZBCF222和ZBatt株感染牛原代腎細(xì)胞后病毒RNA復(fù)制及宿主因子差異表達(dá)結(jié)果Fig.5 Viral RNA and host factors replication levels in BK cells at desired time points post-infection with ZBCF222 strain or ZBatt strain
在FMDV的研究中,乳鼠是敏感的試驗動物,常用于FMDV病毒分離、毒力測定等實驗[12]。本研究中ZB病毒對乳鼠致病性試驗表明,兔化弱毒株ZBatt對乳鼠的致病性明顯強(qiáng)于野生型親本強(qiáng)毒株,結(jié)果與病毒在牛體試驗結(jié)果截然相反。分析其原因,可能與病毒本身的特性有關(guān),或者是弱毒株在乳鼠體內(nèi)有繼代適應(yīng)情況,或許還與所使用的乳鼠品系有一定的關(guān)系[12]?;仡橺B病毒繼代培育過程和疫苗生產(chǎn)記錄,減毒后ZB病毒對溫度的敏感性增強(qiáng),溫度對病毒的存活及致病性的影響大,減毒病毒對乳鼠的LD50雖然相對偏低,但其LD50明顯高于其親本強(qiáng)毒株(內(nèi)部資料)。本研究采用相同劑量測定病毒對乳鼠的生存率,結(jié)果與之相同。因此,乳鼠不適合作為實驗動物模型用來評價ZB株致病性差異。
豚鼠是口蹄疫研究中常用的實驗動物。雖然新生乳鼠對FMDV高度敏感,成年鼠、倉鼠也對FMDV敏感,但發(fā)病似乎沒有豚鼠規(guī)律[12]。試驗表明,豚鼠感染FMDV可引起規(guī)律性、典型性發(fā)病,豚鼠可作為FMD抗體檢測、臨床癥狀及病理觀察實驗動物模型,用于口蹄疫疫苗免疫效力評價[13-14]。Asia 1型FMDV疫苗免疫豚鼠后,其抗體水平隨免疫劑量的增加而升高,同源病毒攻毒時的抗體水平與保護(hù)力呈正相關(guān),豚鼠可替代作為實驗動物牛用于滅活疫苗效力檢驗[15]。本研究利用豚鼠作為實驗動物比較ZB病毒強(qiáng)弱毒株毒力差異,結(jié)果提示ZB強(qiáng)弱毒株對豚鼠的致病性與病毒對天然宿主的致病性一致,證明可以用豚鼠作為實驗動物模型比較不同ZB株的毒力差異。
FMDV Lpro缺失突變致弱毒株與野生型病毒感染牛源宿主細(xì)胞后,差異表達(dá)相關(guān)的宿主因子CCL2、IFN-β、ISG15、Mx1、OAS和PKR等,這些因子主要與干擾素誘導(dǎo)基因、趨化因子和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)[10]。本研究比較測定了這6種由FMDV Lpro缺失導(dǎo)致的表達(dá)差異基因,目的是從病毒-宿主相互作用關(guān)系角度,尋找與病毒致病性差異相關(guān)的宿主因子。結(jié)果表明,ZB病毒強(qiáng)弱毒株感染BK細(xì)胞后,這6種宿主因子mRNA相對定量表達(dá)差異不明顯。之前我們比較了ZB病毒致弱前后病毒全基因組發(fā)現(xiàn),在病毒Lpro編碼區(qū),僅存在3個氨基酸(N2D、M143L和E147G)差異[16],利用ZBatt株反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建的Lpro嵌合病毒證明這3個氨基酸突變與ZBatt減毒表型不相關(guān)[17]。因此,本研究中發(fā)現(xiàn)這6個宿主因子表達(dá)差異不顯著,與FMD病毒Lpro突變對病毒毒力改變影響不顯著相關(guān)。提示有必要進(jìn)一步分析FMDV強(qiáng)弱毒株感染天然宿主細(xì)胞引起的mRNA復(fù)制和蛋白差異表達(dá)情況,尋找強(qiáng)弱毒株感染相關(guān)宿主因子變化情況。
綜上所述,F(xiàn)MD兔化弱毒株ZBatt與其親本強(qiáng)毒株對天然來源宿主細(xì)胞存在致病性差異,豚鼠可作為替代牛實驗動物用于ZB病毒毒力差異評價。