王宣敬，楊妍梅，楊 彪，王玉桂，扎西英派

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州730030)

食品用蠟是一個(gè)廣泛的概念,它指的是直接或間接用于食品及相關(guān)材料中的一些天然動(dòng)植物分泌物,其質(zhì)地如蠟,而又與其他化工產(chǎn)品的蠟質(zhì)物有本質(zhì)上的不同[1]。食品用蠟作為一種涂被劑而廣泛用于水果和蔬菜表面,可以防止水分蒸發(fā)和細(xì)菌侵入,延長(zhǎng)其保質(zhì)期,從而達(dá)到果蔬保鮮的目的,常用做水果涂被劑的蠟有巴西棕櫚蠟、液體石蠟等[2]。無(wú)論何種形式的食品用蠟,都會(huì)對(duì)人和動(dòng)物體的消化系統(tǒng)造成不同程度的損害。蠟制品在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)很難被消化,有報(bào)道稱(chēng)只有部分鳥(niǎo)類(lèi)擁有消化蠟的能力[3],微量食品用蠟的攝入,一般不會(huì)對(duì)機(jī)體造成太大影響,但如果食用量過(guò)多或蠟制品在體內(nèi)蓄積,會(huì)使得人體排毒和分解器官(肝臟、腎臟)負(fù)擔(dān)過(guò)重,影響機(jī)體健康[4]。目前,食品用蠟進(jìn)入消化道后其黏膜免疫系統(tǒng)的反應(yīng)情況未見(jiàn)報(bào)道,食品用蠟對(duì)動(dòng)物機(jī)體的安全性有待再次評(píng)估。試驗(yàn)以大白鼠為模型,選用食品用蠟中使用較多的巴西棕櫚蠟(植物蠟)和液體石蠟(工業(yè)蠟)為試驗(yàn)材料,探究食品用蠟對(duì)大白鼠腸道黏膜及其相關(guān)淋巴組織的影響,對(duì)大白鼠腸道黏膜免疫系統(tǒng)有一個(gè)整體認(rèn)識(shí),為下一步研究食品用蠟對(duì)大白鼠黏膜免疫系統(tǒng)各項(xiàng)功能的影響奠定基礎(chǔ)。從而為食品用蠟的限量以及食品安全提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康的經(jīng)檢疫合格且生長(zhǎng)良好體重200 g 的SPF 級(jí)SD 大鼠24 只(雌雄各半),購(gòu)自甘肅省蘭州市榆中縣動(dòng)物市場(chǎng)。

1.2 藥品與試劑 食品用蠟(巴西棕櫚蠟、液體石蠟),上海新諾化工有限公司生產(chǎn)；甲醛溶液、乙醇、冰醋酸和二甲苯(均為分析純),天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；醇溶性伊紅(Eosin Y)、蘇木精(Hematoxylin),上海伯奧生物科技有限公司生產(chǎn)；石蠟,上海標(biāo)本模型廠生產(chǎn)。

1.3 主要儀器 數(shù)碼照相機(jī)(型號(hào)為Nikoncoolpix 4500),日本尼康公司生產(chǎn)；鍍鉻游標(biāo)卡尺(型號(hào)為0 ～200 mm,精確度0.02 mm),上海申韓量具有限公司生產(chǎn)；電子天平(型號(hào)為SL-N),上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；可調(diào)式電熱板(型號(hào)為ML-1.8-4),北京科偉永興儀器有限公司生產(chǎn)；恒溫干燥器(型號(hào)為KW-I),上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；石蠟切片機(jī)(型號(hào)為L(zhǎng)EICA Histo stat 820)、光學(xué)顯微鏡(型號(hào)為L(zhǎng)EICA-DM500),德國(guó)萊卡公司生產(chǎn)；攤片機(jī)(型號(hào)為HD-P)、烘片機(jī)(型號(hào)為HD-H),浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；自動(dòng)染色儀(型號(hào)為MICROM HMS70),德國(guó)MICROM 公司生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡及Pro-express 圖像采集系統(tǒng)(型號(hào)為OLYMPUS BX-UCB/BX61),日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物建立模型 所用試驗(yàn)動(dòng)物為年齡平均2-3 月齡雌雄各半的大白鼠24 只,前期飼喂?fàn)I養(yǎng)飼料適應(yīng)2 日。將24 只大白鼠分為3 組,對(duì)照組(生理鹽水灌胃)8 只,試驗(yàn)組1(巴西棕櫚蠟灌胃)8只,試驗(yàn)組2(液體石蠟灌胃)8 只,參照相關(guān)文獻(xiàn)每隔1 d 灌胃1 次[4],按等效劑量換算0.01 mL/100 g,灌胃15 d,灌胃期間按照大白鼠正常的采食量喂食鼠糧30 g。

2.2 樣本采集 對(duì)大白鼠進(jìn)行急性失血處死,迅速剖檢,分離出消化道,結(jié)扎幽門(mén)口和回盲口,摘取完整的腸道,去除腸管周?chē)炯敖Y(jié)締組織,置于新配制的生理鹽水(37 ℃)中(注意不要損傷腸黏膜),待腸道內(nèi)容物自行脫落,腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn),迅速置4%甲醛溶液(pH 值7.4)中固定12 h 后換液固定10 d[5]。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 解剖學(xué)檢查 每組隨機(jī)選取4 只經(jīng)急性失血處死的大白鼠完整腸道,去除腸管周?chē)炯敖Y(jié)締組織,沿腸系膜縱行剖開(kāi)腸管,暴露黏膜面,觀察黏膜的形態(tài)并統(tǒng)計(jì)黏膜表面派伊爾淋巴集結(jié)(Peyer′s patch,PP)。按照解剖學(xué)特征標(biāo)記出十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸,記錄各腸段PP 的數(shù)量、形態(tài)特征和分布情況,并拍照采集各腸段黏膜及PP 的解剖學(xué)圖片。用作解剖學(xué)數(shù)據(jù)采集的腸道,因其黏膜已經(jīng)受到損傷,因此不再用于組織學(xué)檢查。

2.3.2 組織學(xué)檢查 對(duì)4%甲醛溶液固定的小腸及大腸腸段以5 cm 為間隔進(jìn)行樣本采集,樣本長(zhǎng)度約1 cm,按試驗(yàn)分組進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)所采集樣本進(jìn)行石蠟包埋,常規(guī)切片(厚度為6 μm),蘇木精-伊紅染色(H.E.染色)和PAS 染色[6],經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察并用Pro-express 圖像采集系統(tǒng)采集照片。

2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)所得解剖學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)試驗(yàn)組與對(duì)照組腸道PP 的形態(tài)特征、數(shù)量和分布情況進(jìn)行對(duì)比分析。按照解剖學(xué)進(jìn)行分段(十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸),每個(gè)腸段隨機(jī)選取10 張組織切片,使用Image-Pro Plus 6.0 圖像測(cè)量分析系統(tǒng),測(cè)算每10 mm2面積內(nèi)固有層與黏膜下層內(nèi)淋巴濾泡的數(shù)量,每張切片中選取3 根柱狀排列整齊且最長(zhǎng)的腸絨毛統(tǒng)計(jì)杯狀細(xì)胞的數(shù)量[7]。采用SPSS 21.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P ＜0.05 表示差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 解剖學(xué)檢查

3.1.1 腸黏膜變化及黏膜PP 形態(tài)特征 對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組大白鼠的腸道黏膜表面進(jìn)行解剖觀察,各組僅在空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)明顯的派伊爾淋巴集結(jié),對(duì)比發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組大白鼠小腸的PP 均為結(jié)節(jié)狀,大腸為火山口狀和結(jié)節(jié)狀,其形態(tài)無(wú)明顯差異；且腸黏膜均無(wú)病理變化。解剖學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)食品用蠟對(duì)腸道造成形態(tài)學(xué)損傷。各組小腸及大腸黏膜表面PP 的對(duì)比見(jiàn)圖1、2、3、4。

圖1 空腸黏膜表面PP 對(duì)比

圖2 回腸黏膜表面PP 對(duì)比

圖3 盲腸黏膜表面PP 對(duì)比

圖4 結(jié)腸黏膜表面PP 對(duì)比

3.1.2 腸黏膜PP 數(shù)量及分布 對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組大白鼠的腸道黏膜表面的PP 進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì),小腸黏膜表面PP 主要分布于空腸和回腸；大腸黏膜表面PP 主要分布于盲腸和結(jié)腸。對(duì)比試驗(yàn)組和對(duì)照組各腸段PP 數(shù)量分布,三組數(shù)量分布差異不顯著(P ＞0.05)。

表1 各組腸道各段PP 分布數(shù)量分析

3.2 組織學(xué)檢查

3.2.1 腸黏膜組織學(xué)特征 組織學(xué)結(jié)果選取了黏膜形成環(huán)狀襞、內(nèi)有密集腸絨毛、腸段最長(zhǎng)的空腸,觀察發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組腸黏膜完整性被破壞,腸黏膜部分脫落。 灌胃液體石蠟組較灌胃巴西棕櫚蠟組嚴(yán)重,對(duì)照組無(wú)明顯變化。 結(jié)果表明,食品用蠟對(duì)腸絨毛有損傷效果。 腸絨毛對(duì)比見(jiàn)中插彩版圖5。

3.2.2 腸黏膜表面相關(guān)淋巴組織的組織學(xué)分布 組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),腸道黏膜淋巴組織主要分布于腸黏膜固有層和黏膜下層,且在鏡下表現(xiàn)為由固有層向下延伸到達(dá)黏膜下層,主要以彌散的淋巴組織(Diffuse lymphoid tissue , DLT)、孤立的淋巴小結(jié)(ILF)和淋巴集結(jié)(ALN)的形式存在。對(duì)PP 單位面積內(nèi)(每10 mm2內(nèi))淋巴濾泡數(shù)量計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì),結(jié)果發(fā)現(xiàn),食品用蠟并未刺激腸道黏膜表面相關(guān)淋巴組織數(shù)量的顯著改變。腸黏膜表面PP 內(nèi)淋巴濾泡的數(shù)量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組腸道各段淋巴濾泡數(shù)量分析

3.2.3 腸黏膜表面杯狀細(xì)胞的數(shù)量 灌胃巴西棕櫚蠟組與對(duì)照組對(duì)比,杯狀細(xì)胞的數(shù)量無(wú)顯著差異(P ＞0.05)；灌胃液體石蠟的試驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比,杯狀細(xì)胞的數(shù)量差異顯著(P ＜0.05),說(shuō)明液體石蠟的存在使腸道黏膜表面的杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。 腸黏膜表面杯狀細(xì)胞的數(shù)量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3?？漳c懷狀細(xì)胞數(shù)量對(duì)比見(jiàn)中插彩版圖6。

表3 各組腸道各段杯狀細(xì)胞數(shù)量分析

4 討論

4.1 食品用蠟對(duì)大白鼠腸道黏膜的影響 腸道是機(jī)體內(nèi)消化與吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所,食品用蠟被攝入后在腸道存在的時(shí)間最長(zhǎng),不同種類(lèi)的食品用蠟對(duì)腸黏膜產(chǎn)生的效果也不相同,巴西棕櫚蠟為植物蠟,液體石蠟為工業(yè)蠟,組織學(xué)結(jié)果顯示,液體石蠟造成腸黏膜絨毛的脫落,其程度高于巴西棕櫚蠟,試驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)腸黏膜中存在試驗(yàn)用蠟,從而不能確定腸道對(duì)試驗(yàn)用蠟是否有吸收作用,但可以確定試驗(yàn)用蠟可以對(duì)腸道黏膜造成不同程度的損傷。

杯狀細(xì)胞是一種典型的糖蛋白分泌細(xì)胞,其分泌的黏蛋白釋入管腔內(nèi)成為潤(rùn)滑性黏液涂布于黏膜表面,對(duì)腸黏膜表面有保護(hù)作用[8]。腸道上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞來(lái)源于腸腺內(nèi)杯狀細(xì)胞分化,逐步向上遷移至絨毛,最后從絨毛頂端死亡脫落。Grant 等[9]研究發(fā)現(xiàn),大鼠腸道的杯狀細(xì)胞位于結(jié)腸腺底部的干細(xì)胞在向表面遷移的過(guò)程中增殖、分化形成,而且在腸腺基底部增生速度最快,但其遷移速度比其他上皮細(xì)胞慢得多。結(jié)果顯示,液體石蠟可以刺激腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量的增加。原因可能是在大白鼠灌胃液體石蠟后,激活了機(jī)體腸道黏膜保護(hù)功能,在刺激因子作用下,杯狀細(xì)胞增生,細(xì)胞分泌功能增強(qiáng),參與腸道內(nèi)的石蠟乳糜的清除。杯狀細(xì)胞分泌的黏液潤(rùn)滑了腸道,使得消化道內(nèi)糞便軟化,從而排除消化道內(nèi)不能被吸收的石蠟乳糜。而巴西棕櫚蠟對(duì)腸黏膜的刺激較小,杯狀細(xì)胞的數(shù)量變化不明顯。

4.2 食品用蠟對(duì)大白鼠腸黏膜相關(guān)淋巴組織的影響 通過(guò)試驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)的對(duì)比,未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)用蠟對(duì)腸黏膜相關(guān)淋巴組織的形態(tài)和數(shù)量分布產(chǎn)生明顯的影響。試驗(yàn)組與對(duì)照組腸黏膜表面PP 從十二指腸到直腸,形態(tài)結(jié)構(gòu)均未發(fā)生明顯變化,與前面腸段相比在直腸的PP 有縮小退化的趨勢(shì),因?yàn)橹蹦c位于腸道的后段,消化吸收和免疫功能減弱,淋巴組織逐漸退化。在空腸處PP 為結(jié)節(jié)狀,在盲腸處為火山口狀,在結(jié)腸處為結(jié)節(jié)狀,火山口狀和結(jié)節(jié)狀的外觀可以達(dá)到既不影響正常的內(nèi)容物運(yùn)行,又能起到類(lèi)似于“陷窩”的效果,在抗原物質(zhì)沉積到該結(jié)構(gòu)內(nèi)部后,引起免疫誘導(dǎo)反應(yīng)[10]。試驗(yàn)組和對(duì)照組腸黏膜表面PP 和淋巴濾泡的數(shù)量差異不顯著(P ＞0.05)。從十二指腸到直腸的整個(gè)腸道,PP 和淋巴濾泡的數(shù)量分布呈空腸最多,其他腸段次之,這種分布特點(diǎn)是由于大白鼠的腸道內(nèi)容物從十二指腸起始,根據(jù)腸段的長(zhǎng)度不同,在各腸段停留時(shí)間不同,為了發(fā)揮更好的免疫效果,PP 和淋巴濾泡的數(shù)量分布也就不相同[11]。

綜上所述,試驗(yàn)所用食品用蠟對(duì)腸道黏膜及其相關(guān)淋巴組織產(chǎn)生不同程度的影響,其影響主要表現(xiàn)在對(duì)腸黏膜表面絨毛的破壞和引起杯狀細(xì)胞數(shù)量的增加,但未發(fā)現(xiàn)食用蠟對(duì)黏膜相關(guān)淋巴組織的明顯損傷,在腸道是否引起免疫反應(yīng),有待于后續(xù)試驗(yàn)和研究。巴西棕櫚蠟作為植物蠟應(yīng)用于食品用蠟對(duì)腸道的損傷相對(duì)于液體石蠟小。試驗(yàn)研究為進(jìn)一步研究食品用蠟對(duì)動(dòng)物機(jī)體消化與免疫系統(tǒng)的影響提供基礎(chǔ)。為食品用蠟的選擇、限量和食品安全提供了參考。