陶 婭，王鉉皓，李軍朝，徐 磊，朱永江，吳鐵花，劉慧謀，王彥紅，3

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州225009)

多殺性巴氏桿菌(Pm)可以導(dǎo)致家畜和禽類(lèi)的多種巴氏桿菌病,該菌可引起雞、鴨等禽類(lèi)的禽霍亂。雞、鴨等禽類(lèi)暴發(fā)禽霍亂時(shí)多表現(xiàn)為突然發(fā)病,同時(shí)伴有下痢呈敗血性的癥狀,該病暴發(fā)時(shí)其發(fā)病率與死亡率都極高,給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的損失和威脅。禽霍亂主要侵害對(duì)象為成年禽類(lèi),以性成熟后的禽類(lèi)最為易感,暴發(fā)季節(jié)主要在夏季、秋季和冬季,這種季節(jié)性的流行主要是由于環(huán)境因素影響造成的[1],因此,2017 年夏、秋季江蘇各地散養(yǎng)禽類(lèi)暴發(fā)禽霍亂是由于7 ～9 月份溫?zé)岫嘤?環(huán)境潮濕,病原菌在場(chǎng)地不能自然凈化。更為嚴(yán)重的是該病一旦暴發(fā),在發(fā)病禽類(lèi)舍飼內(nèi)很難被完全清除,禽霍亂可以在同一場(chǎng)地連續(xù)發(fā)生[2]。將禽霍亂病例進(jìn)行細(xì)菌分離、分子鑒定、藥敏試驗(yàn),為該病的臨床用藥和防控提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑 采用購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司的綿羊血和瓊脂粉,按照通用組方配置成綿羊血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板。藥敏試紙片,購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。本次試驗(yàn)所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 細(xì)菌分離 2017 年1 月-12 月間于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院畜禽門(mén)診部收集禽霍亂病料,共收集到12份病料(詳見(jiàn)表1)。采集病禽的肝臟、心臟和脾臟等主要病變器官,按照無(wú)菌要求,用接種環(huán)挑取病料接種于綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況,將生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落進(jìn)行純化傳代分別接種于綿羊血培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基,并繼續(xù)觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況。

表1 分離菌株的背景來(lái)源

1.3 PCR 方法鑒定多殺性巴氏桿菌及其莢膜血清型 使用煮沸裂解的傳統(tǒng)方法來(lái)提取分離菌株中的DNA 模板,再根據(jù)Townsend[3]描述的試驗(yàn)方法來(lái)鑒定分離菌株,先用kmt 引物對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定,再capA 特異性引物鑒定分離菌株的血清型,從而得出分離菌株的莢膜血清型。

1.4 MLST 分析 根據(jù)est、pmi、adk、pgi、mdh、gdh、zwf 這7 個(gè)多殺性巴氏桿菌的管家基因?qū)Ψ蛛x菌株進(jìn)行PCR[4]。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步鑒定后,將其送往南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。得到分離菌株所對(duì)應(yīng)的等位基因后上傳至(http://pubmlst.org/pmultocida_rirdc/)以獲取相關(guān)的ST。

1.5 藥敏試驗(yàn) 采用Kirby-Bauer 藥敏紙片的方法,選取頭孢曲松、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西環(huán)素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和妥布霉素這15 種藥敏紙片,在無(wú)菌條件下,挑取純化后的菌株,在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上劃線(xiàn)涂布均勻后,取藥敏紙片均勻分布貼于瓊脂面上,在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況,并且直接測(cè)量藥物的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 分離所得的12 株細(xì)菌在綿羊血瓊脂上生長(zhǎng)良好,呈露珠樣無(wú)色透明濕潤(rùn)的針尖大小的菌落。12 株菌株在麥康凱培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)。

2.2 PCR 方法鑒定多殺性巴氏桿菌及其莢膜血清型 分離菌株用kmt 引物進(jìn)行PCR,將產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳后出現(xiàn)約為500 bp 的條帶(圖1),從而進(jìn)一步確定分離所得菌株為多殺性巴氏桿菌。利用capA 的PCR 引物,對(duì)其進(jìn)行PCR,將產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)約為1 000 bp 的條帶(圖2),因此確定分離株為莢膜血清A 型的多殺性巴氏桿菌。

圖1 kmt 基因PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 MLST 分析 根據(jù)adk、est、pmi、zwf、mdh、gdh、pgi 這7 個(gè)多殺性巴氏桿菌的管家基因?qū)Ψ蛛x菌株進(jìn)行PCR,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別均出現(xiàn)570 bp、641 bp、739 bp、614 bp、620 bp、702 bp、784 bp 這7條目的條帶(圖3)。測(cè)序結(jié)果12 株細(xì)菌adk 均為21,est 均為33,pmi 均為26,zwf 均為2,mdh 均為17,gdh 均為20,pgi 均為20。因此,12 株分離株的序列型均為ST-129。

圖2 莢膜血清型PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖3 MLST 7 個(gè)基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏結(jié)果顯示,對(duì)于不同的抗生素分離菌的敏感性不同,12 株多殺性巴氏桿菌的耐藥率分別是:強(qiáng)力霉素(58.3%)、卡那霉素(50%)、環(huán)丙沙星(25%)、鏈霉素(41.7%)、諾氟沙星(25%)、新霉素(33.3%)、復(fù)方新諾明(25%)、慶大霉素(8.3%)、左氧氟沙星(8.3%)、美洛西林(8.3%)、菌必治(8.3%)、妥布霉素(8.3%),而對(duì)丁胺卡那霉素、氟苯尼考、多粘菌素B 均敏感。

3 討論

3.1 多殺性巴氏桿菌的分離鑒定 從臨床送檢的12 份病料中分離出細(xì)菌,經(jīng)PCR 鑒定12 株分離菌都是莢膜血清型A 型的多殺性巴氏桿菌,其序列型皆為ST-129。多殺性巴氏桿菌是動(dòng)物臨床上危害較大的病原微生物,其宿主廣泛,多種家畜與禽類(lèi)甚至一部分野生動(dòng)物都可感染,并且感染后可引起多種的疾病和臨床表現(xiàn)。我國(guó)禽源多殺性巴氏桿菌的莢膜血清型以A 型為主,且在江蘇地區(qū)流行株序列型為ST-129,多殺性巴氏桿菌的血清型、序列與其致病性存在一定的聯(lián)系,因此在臨床上建立多殺性巴氏桿菌分離株的快速分型鑒定對(duì)了解其致病規(guī)律和感染具有重要的意義[5-7]。多殺性巴氏桿菌常使雞、鴨等禽類(lèi)爆發(fā)禽霍亂,給我國(guó)的禽類(lèi)養(yǎng)殖市場(chǎng)帶來(lái)了巨大的損失和隱患,針對(duì)江蘇及周邊地區(qū)流行菌株的基因型單一性現(xiàn)象,使用全價(jià)細(xì)菌滅活菌苗對(duì)于該病的預(yù)防可能有較好的作用。

3.2 多殺性巴氏桿菌的藥物治療 12 株分離菌藥敏結(jié)果顯示,該菌對(duì)強(qiáng)力霉素和卡那霉素有較強(qiáng)的耐藥性,但不同來(lái)源的分離菌株所產(chǎn)生的耐藥性不同。其中12 株多殺性巴氏桿菌僅有兩株對(duì)強(qiáng)力霉素敏感,其余10 株均產(chǎn)生不同程度耐藥性。強(qiáng)力霉素抗菌譜廣,且藥物口服后吸收作用快,在體內(nèi)維持時(shí)間長(zhǎng),禽類(lèi)養(yǎng)殖中經(jīng)常使用該藥用以治療和預(yù)防疾病。該藥的濫用是臨床上分離菌株產(chǎn)生耐藥性的主要原因。有關(guān)研究表明,不同地區(qū)的多殺性巴氏桿菌其耐藥性具有一定的地域差異性[8]。為了降低耐藥菌株的產(chǎn)生,臨床要科學(xué)合理的使用抗生素,使用時(shí)要考慮抗生素的質(zhì)量、劑量、療程和使用方法,以減少耐藥性的產(chǎn)生。