岳芳芳，倪文娟，冷小敏，劉 云，師晶晶，曹東東，郭明好，馬東紅

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院a.腎臟病醫(yī)院腎臟免疫研究所；b.生命科學(xué)研究中心，河南衛(wèi)輝 453100)

白介素10(interleukin-10，IL-10)是目前公認(rèn)的抗炎與免疫抑制因子，它主要由Th2細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥疾病、自身免疫性疾病、器官移植、血液疾病及癌癥中具有重要價(jià)值，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)[1]。研究表明IL-10參與糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)生，其可能成為DN治療的新靶點(diǎn)之一。而既往關(guān)于IL-10在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)或DN中表達(dá)水平的研究得出了相矛盾的結(jié)論[2-5]，為進(jìn)一步明確IL-10在DN患者中的表達(dá)水平，我們有必要建立一種穩(wěn)定、靈敏的檢測(cè)方法。本研究主要從模板濃度、引物篩選兩方面優(yōu)化IL-10 RNA熒光定量技術(shù)，并進(jìn)一步對(duì)IL-10在DN組及對(duì)照組中的表達(dá)水平進(jìn)行批量對(duì)比，為DN發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 DN組：選取2017年8月～2018年5月于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科及內(nèi)分泌科住院的33例DN患者，其中DNⅢ期患者11例，平均年齡58.91±10.50歲；DNⅣ期患者22例，平均年齡57.55±10.43歲。對(duì)照組：健康體檢人員35例，平均年齡53.66±5.80歲。其中，DN組T2DM的診斷符合中國(guó)2型糖尿病防治指南(2017年版)[6]中T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)Mogensen分期，達(dá)到DNⅢ期、Ⅳ期標(biāo)準(zhǔn)。所有入組研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)Genbank中人IL-10，β-actin的基因序列信息，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物(分別簡(jiǎn)稱P1，P2，P3)。由北京六合華大基因科技有限公司合成。IL-10的熒光定量PCR擴(kuò)增引物信息見表1。

表1 IL-10的熒光定量PCR擴(kuò)增引物

1.3.2 血液樣本處理：抽取外周靜脈血3 ml置于抗凝管中，4℃保存，24 h內(nèi)進(jìn)行處理。

分離淋巴細(xì)胞：3ml人外周血淋巴細(xì)胞分離液加3ml的全血離心，600 g 20 min。吸取環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一離心管中；加入同體積的生理鹽水清洗淋巴細(xì)胞，250 g離心10 min后棄上清；重復(fù)清洗2次；棄上清后得細(xì)胞，加入500 μl的RNAiso Plus裂解細(xì)胞。

1.3.3 RNA的提取及cDNA的合成：提取RNA：向上述勻漿裂解液中加入三氯甲烷(RNAiso Plus的1/5體積量)，混勻，室溫靜置5 min。4℃ 12 000 g離心15 min，吸取上清液至另一離心管中。向上清中加入0.5倍RNAiso Plus體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min。4℃ 12 000 g離心10 min，棄上清，加入與RNAiso Plus等量的75%(v/v)乙醇，上下顛倒洗滌離心管管壁；4℃ 7 500 g離心5 min后棄上清。室溫沉淀干燥5 min，沉淀干燥后，加入20 μl的RNase-free水溶解沉淀。經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，并取2 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)進(jìn)行基因組DNA的去除并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化：20 μl反應(yīng)體系：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μl，cDNA模板1 μl(在原液的基礎(chǔ)上稀釋不同的倍數(shù)：100，101，102，103，104)，滅菌水7 μl。程序設(shè)置：預(yù)變性95℃ 30s，變性95℃ 5s，延伸60℃ 34s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線階段95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。在反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，使用3對(duì)不同的引物(P1，P2，P3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.5 特異性檢測(cè)：熒光定量PCR結(jié)果熔解曲線分析查看是否有特異型單峰，并進(jìn)一步將熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

2結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 P1的相關(guān)系數(shù)為0.976 7，斜率為-2.474 6；P2的相關(guān)系數(shù)為0.782 2，斜率為-1.902 3；P3的相關(guān)系數(shù)為0.999 6，斜率為-3.272 2。在P3擴(kuò)增體系下可以得到最優(yōu)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使起始模板濃度與循環(huán)數(shù)有良好的線性關(guān)系。

2.2 擴(kuò)增曲線、熔解曲線 P3的擴(kuò)增曲線符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”形熒光擴(kuò)增曲線，曲線拐點(diǎn)清楚，基線平而無明顯上揚(yáng)趨勢(shì)；熔解曲線呈單一的主峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物特異，沒有非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)，見圖1。

A：cDNA模板在100，101，102，103稀釋倍數(shù)下，引物為P3時(shí)獲得的擴(kuò)增曲線；B：引物為P3時(shí)獲得的熔解曲線。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳 應(yīng)用P1，P3擴(kuò)增的產(chǎn)物基本穩(wěn)定，在cDNA模板稀釋倍數(shù)為100時(shí)，條帶清晰、穩(wěn)定，分辨率高；電泳僅觀察到一個(gè)預(yù)測(cè)大小的單條帶，說明特異性擴(kuò)增無明顯的副產(chǎn)物；當(dāng)cDNA模板稀釋倍數(shù)為103，104時(shí)，在P1，P3未見擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖2。

M：分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000；1～5：熒光定量cDNA模板稀釋倍數(shù)依次為：100，101，102，103，104；A，B，C分別為P1，P2，P3在不同cDNA模板稀釋倍數(shù)下擴(kuò)增的電泳成像結(jié)果。

圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖像

2.4 DN組與對(duì)照組IL-10 RNA表達(dá)水平 將建立的實(shí)驗(yàn)條件用于檢測(cè)兩組IL-10RNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組(14.39±1.14)相比，DN組(16.21±1.84)的RNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.049，P<0.01)。考慮到DNⅢ期、DNⅣ期的臨床表現(xiàn)不同，其IL-10RNA表達(dá)可能存在差異。因此，我們又進(jìn)行了組間對(duì)比，結(jié)果顯示：DNⅣ期患者的RNA水平較DNⅢ期患者稍有升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.537，P=0.129)；但與對(duì)照組相比，DNⅢ期(16.69±1.06)與DNⅣ期(15.96±2.09)患者IL-10RNA的表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.452，5.248，均P<0.01)。

3討論以往研究表明，炎癥在DN的進(jìn)展中起著重要作用[7]。IL-10作為目前公認(rèn)的抗炎與免疫抑制因子，在DN的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要價(jià)值。關(guān)于在T2DM或DN中IL-10表達(dá)水平的檢測(cè)，目前的研究大部分都采用ELISA法，但得出了相矛盾的研究結(jié)果[2-5]。ELISA的檢測(cè)方法需要特異的抗體和一定量的蛋白，在進(jìn)行抗原或抗體檢測(cè)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性，靈敏度不高[8]；對(duì)分析低水平表達(dá)的細(xì)胞因子不夠敏感，且只能從單個(gè)樣本中分析有限的細(xì)胞因子。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)技術(shù)具有操作方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異度強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，即使是對(duì)低水平的細(xì)胞因子基因表達(dá)，也是一種有效的定量方法。近年來，qPCR被廣泛用于定量細(xì)胞、體液、組織或組織活檢中RNA的表達(dá)水平。該技術(shù)不僅在分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域得到了充分利用，在許多疾病的診斷方面，特別是腫瘤的早期診斷、療效觀察以及癌基因與腫瘤的關(guān)系方面也有涉及[9-10]。但qPCR 對(duì)反應(yīng)條件的變化相當(dāng)敏感，一旦條件不合適便得不到理想的結(jié)果，所以優(yōu)化反應(yīng)條件是qPCR獲得可靠結(jié)果的前提[11]。

本研究利用qPCR來檢測(cè)IL-10RNA表達(dá)，從模板濃度、引物篩選兩方面進(jìn)行探索，當(dāng)20 μl反應(yīng)體系475 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后取1 μl，引物為F：5’-GTGATGCCCCAAGCTGAGA-3’，R：5’-CACGGCCTTGCTCTTGTTTT-3’時(shí)，能夠得到較為穩(wěn)定靈敏的擴(kuò)增效果。我們前期通過ELISA法對(duì)比兩組IL-10表達(dá)水平，結(jié)果顯示DN組IL-10表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是一致的，進(jìn)一步證實(shí)IL-10是參與DN發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其在DN患者中表達(dá)下調(diào)。

在關(guān)于IL-10在T2DM或DN中表達(dá)水平的研究中，本研究結(jié)果與YUAN等[4-5]一致，但與AL-SHUKAILI等[2-3]相反，考慮有以下原因：與以往研究不同，在關(guān)于DN患者的研究中我們首次參考了Mogensen分期，本研究中病例組主要以DNⅢ期、Ⅳ期為研究對(duì)象。WONG等[3]的研究未對(duì)入組標(biāo)本進(jìn)行分期；AL-SHUKAILI等[2]的研究中其研究對(duì)象為T2DM患者，尚未發(fā)展至DN階段。因此研究結(jié)果不一致可能與入組標(biāo)準(zhǔn)不一致、入組患者結(jié)構(gòu)、年齡及病程存在差異有關(guān)。另外，本研究中DNⅢ期、Ⅳ期患者的IL-10RNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能受樣本量小的影響。綜上，本研究?jī)?yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定，利于臨床推廣應(yīng)用；該檢測(cè)方法可為DN抗炎機(jī)制的研究提供技術(shù)支持。