方雷　陳根元　劉利林　周小玲

摘要：運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)研究新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸中固相食糜細(xì)菌組成多樣性。選用3頭成年、健康新疆驢，自由采食90%稻草+10%精料混合日糧，舍飼30 d后屠宰、分段取樣備用。經(jīng)過微生物基因組提取、目標(biāo)片段擴(kuò)增、變性梯度凝膠電泳、圖像分析和數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表明，不同腸道固相食糜細(xì)菌條帶組成上有相似區(qū)域，也有各自的特異條帶，而同一腸道段的個(gè)體樣本間的細(xì)菌條帶具有較高相似性，且盲腸固相食糜細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)最大，與腹結(jié)腸差異不顯著，但都分別顯著高于背結(jié)腸。新疆驢盲腸固相食糜細(xì)菌多樣性最為豐富，腹結(jié)腸次之，背結(jié)腸相對(duì)最弱。

關(guān)鍵詞：新疆驢;盲腸;腹結(jié)腸;背結(jié)腸;固相食糜;細(xì)菌多樣性

中圖分類號(hào)： S822.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0176-03

驢屬于單胃草食動(dòng)物，與豬禽等單胃動(dòng)物不同，具有發(fā)達(dá)的盲腸和結(jié)腸，這是驢重要的消化器官。腸道內(nèi)長(zhǎng)期寄居著種類豐富、數(shù)量龐大的微生物，彼此間協(xié)同作用發(fā)酵、降解消化道食糜，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，為宿主提供養(yǎng)分。有關(guān)研究結(jié)果表明，驢對(duì)稻草、麥秸、玉米秸稈日糧中的中性洗滌纖維（NDF）消化率為40%～50%，與牛羊等反芻動(dòng)物對(duì)這3種秸稈日糧的NDF消化能力相當(dāng)，說明驢的盲腸、結(jié)腸的腸道微生物對(duì)秸稈粗飼料有較強(qiáng)的降解能力[1]，其功能類似于反芻動(dòng)物的瘤胃。反芻動(dòng)物的瘤胃微生物主要黏附在飼料顆粒上、存在于瘤胃液中和附著于瘤胃內(nèi)壁上[2]，且瘤胃固相食糜中的微生物數(shù)量高于液相，是瘤胃中的主要功能微生物[3-5]。瘤胃微生物的多樣性受飼料組成[6]、宿主遺傳背景[7]和環(huán)境等因素影響[8];反芻動(dòng)物的瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃4個(gè)胃室中菌群多樣性也不一樣，呈現(xiàn)先高后低再升高的趨勢(shì)[9]。驢的盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸是日糧中纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解的重要場(chǎng)所，不同消化部位的固相食糜細(xì)菌多樣性如何變化是本研究的切入點(diǎn)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物、時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年6月5日至7月5日在塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)養(yǎng)殖基地進(jìn)行。試驗(yàn)選用3頭成年、健康、3～4歲新疆驢，舍飼喂以含有90%粉碎稻草和10%精料（70%玉米粉+30%棉粕）的混合日糧，自由采食、飲水，飼養(yǎng)30 d。

1.2樣品處理

飼養(yǎng)結(jié)束后，屠宰前1 d晚上禁食、供水，屠宰前先用鈍器打擊頭部致暈，立即頸動(dòng)脈放血、開膛、暴露內(nèi)臟;找到“逗號(hào)”狀盲腸，隨后向后繼續(xù)找到膨大腹結(jié)腸、膨大背結(jié)腸，用繩子扎緊各段間狹小接口，水平放置，從各腸道段中部取樣;分別采集盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸食糜，并用4層滅菌紗布過濾，將過濾后的固相食糜迅速收集于數(shù)個(gè)2 mL滅菌指形管中，立即投入液氮罐于實(shí)驗(yàn)室，分類保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3食糜微生物總DNA提取

參照Kang等[10]和Laure等[11]的方法洗脫固相食糜上附著的微生物，用天根生物技術(shù)有限公司微生物基因組DNA提取試劑盒（DP328）提取微生物基因組總DNA，具體步驟按說明書操作。

1.4目標(biāo)片段擴(kuò)增及檢測(cè)

試驗(yàn)采用細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)通用引物對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物HDA1-GC序列為：5′-[JP9]CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，下游引物HDA2序列為：5′-[JP9]GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′。以上引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，可擴(kuò)增長(zhǎng)約200 bp的目標(biāo)片段。

PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物由 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5變性梯度凝膠電泳

試驗(yàn)中DGGE采用10%聚丙烯酰胺凝膠，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺比例為37.5 ∶1，變性劑濃度梯度為45%～60%。電泳采用Dcode DGGE系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)），在 0.5×TAE緩沖液中、60 ℃恒溫下進(jìn)行，200 V預(yù)電泳10 min，85 V電泳16 h。電泳結(jié)束后，用0.5 μg/mL的EB溶液染色30 min，用凝膠成像系統(tǒng)（Gel DOCTM XR+，Bio-Rad美國(guó)）檢測(cè)、拍照。

1.6圖譜處理與數(shù)據(jù)分析

用Quantity One 4.62軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析，將各泳道條帶光密度值計(jì)算、輸出用于計(jì)算Simpson指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)[12-13]，采用SAS 8.0軟件對(duì)細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行Duncans檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。用NTSYSpc 2.10S對(duì)圖譜條帶聚類分析。

D=1-∑si=1P2i;

H′=-∑si=1PilnPi。

式中：Pi為某樣品中某1條帶光密度值占該樣品中總光密度值的比率，D為Simpson指數(shù)，H′為Shannon-Wiener指數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜微生物總DNA

新疆驢不同段腸道固相食糜微生物總DNA提取結(jié)果見圖1。由圖1可見，盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸各代表樣品分別在 1～9 泳道均有明亮條帶，與marker相比，條帶大小在2.3 ku左右，有稍許拖尾，比較完整，D260 nm/D280 nm比值為1.71，可以用作后續(xù)PCR模板。

2.2新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

以新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜微生物總DNA為模板，細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳、染色、拍照，結(jié)果表明，不同腸道固相食糜各樣本均獲得整齊、明亮的目標(biāo)PCR產(chǎn)物，大小為 200 bp（圖2），符合引物擴(kuò)增預(yù)期產(chǎn)物結(jié)果，可以用于后續(xù)變性梯度凝膠電泳。

2.3新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜

新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜細(xì)菌V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)45%～60%變性梯度凝膠電泳、染色、照相，結(jié)果表明，各腸道段各樣本在各自泳道均出現(xiàn)豐富、明亮、清晰條帶，同一腸道段樣本間有大量相似條帶，不同腸道間既有部分相似條帶，也有所屬腸道段的特異條帶（圖3）。

2.4新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜細(xì)菌DGGE指紋圖譜聚類分析

新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜細(xì)菌PCR-DGGE圖譜聚類分析結(jié)果見圖4。各段腸道固相食糜細(xì)菌條帶都以高于0.93的相似性分別聚合成盲腸（1、2、3）、腹結(jié)腸（4、5、6）和背結(jié)腸（7、8、9）三大類群，腹結(jié)腸和背結(jié)腸又以0.67左右的相似性聚合成大結(jié)腸類群，最后再以0.56相似性和盲腸細(xì)菌條帶聚合成一大簇。

2.5新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜細(xì)菌PCR-DGGE凝膠圖片經(jīng)Quantity One軟件對(duì)各泳道條帶光密度值輸出、多樣性指數(shù)計(jì)算和SPSS統(tǒng)計(jì)分析后，結(jié)果（表1）顯示，新疆驢盲腸固相食糜細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)均為最大，分別為3.209和0.947，與腹結(jié)腸差異不顯著，但均分別極顯著高于背結(jié)腸（P<0.01）。

3討論與結(jié)論

反芻動(dòng)物瘤胃微生物的存在方式，主要以黏附固相飼料顆粒、游離于瘤胃液中和附著于瘤胃內(nèi)壁上，其中固相食糜黏附微生物占瘤胃微生物總數(shù)的50%～70%[14]，以大量纖維降解菌為主，纖維素降解也是瘤胃代謝的限速步驟[15]。通過表1 細(xì)菌多樣性指數(shù)來看，盲腸固相食糜的Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)值都是最大，分別為3.209和0.957，與腹結(jié)腸的3.168和0.927相比差異不顯著，但都分別極顯著高于背結(jié)腸的2.950和0.915（P<0.01）。也就是說，盲腸固相食糜上附著的細(xì)菌種類更加豐富，腹結(jié)腸次之，背結(jié)腸相對(duì)最弱;瘤胃微生物在降解日糧過程中，主要包括附著和酶解2個(gè)過程，其中附著過程是瘤胃微生物降解日糧的前提[16-17]，靠附著微生物間協(xié)同作用降解食糜;推測(cè)盲腸在對(duì)固相食糜顆粒降解的作用要強(qiáng)于腹結(jié)腸，強(qiáng)于背結(jié)腸;可能一方面盲腸是驢大腸微生物發(fā)酵降解食糜重要的起始段，胃、小腸等消化液消化后，食糜中不易被消化或逃脫的易消化養(yǎng)分首先來到盲腸進(jìn)行微生物降解，食糜中的養(yǎng)分組成和含量有利于盲腸微生物的生長(zhǎng)繁殖，使其食糜附著細(xì)菌多樣性更好;另一方面，隨著盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸微生物對(duì)食糜的逐級(jí)降解，食糜中易被利用和能被利用的養(yǎng)分也越來越少，也導(dǎo)致了固相食糜上附著的細(xì)菌多樣性逐漸降低。

從新疆驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸固相食糜指紋圖譜（圖3）可以看出，在相同試驗(yàn)條件下，不同消化道段都獲得了較豐富的細(xì)菌條帶，有共同、特異和很亮的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌條帶，但試驗(yàn)中均未回收、克隆和測(cè)序，無法獲知其分類信息;從聚類信息（圖4）上看，各不同腸道處理內(nèi)的細(xì)菌條帶組成都有0.9以上的相似系數(shù)，而驢的不同腸道處理間只有0.56的相似系數(shù)。本試驗(yàn)中，我們對(duì)新疆驢盲腸、腹結(jié)腸、背結(jié)腸固相食糜附著細(xì)菌多樣性有了初步認(rèn)識(shí)，這些不同消化道微生物差異表現(xiàn)在微生物什么分類水平上，是什么原因造成的仍需進(jìn)一步研究和探討。

新疆驢的相同腸道段固相食糜細(xì)菌組成具有較高的相似性，不同腸道段間細(xì)菌組成有所差異;盲腸固相食糜的細(xì)菌多樣性最為豐富，腹結(jié)腸次之，背結(jié)腸相對(duì)最弱。

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