賈桂枝 王蕊 岳怡 戴紅良

(錦州醫(yī)科大學 1生理學教研室，遼寧 錦州 121001；2第一臨床學院2016級本科；3護理學院)

肝性腦病是引起肝病患者死亡的重要原因。通過尸體解剖與動物實驗發(fā)現(xiàn)肝性腦病中發(fā)生的腦水腫、顱內(nèi)高壓及腦疝是導致死亡的病理基礎(chǔ)〔1〕。人體磁共振成像研究顯示肝性腦病腦水腫屬細胞性水腫，即星形膠質(zhì)細胞水腫〔2〕。研究證實在嚴重肝病時，機體不能對氨進行有效清除，導致患者腦組織氨濃度過度升高，從而引起星形膠質(zhì)細胞水腫及肝性腦病的發(fā)生〔3,4〕。Ca2+是細胞內(nèi)重要的第二信使分子，之前有研究發(fā)現(xiàn)，氨刺激星形膠質(zhì)細胞后可導致細胞內(nèi)Ca2+瞬時增加，進而引起星形膠質(zhì)細胞水腫〔5〕。Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路是細胞內(nèi)介導各種生理、病理效應(yīng)的重要信號通路〔4〕。本文旨在探討該通路是否介導氨引起的星形膠質(zhì)細胞水腫，為進一步理解肝性腦病的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基購自美國康寧公司；馬血清購自Gibco公司；dBcAMP購自美國Sigma公司；Calcein/AM熒光探針購自美國Invitrogen公司；表皮生長因子受體(EGFR)抗體購自美國Cell Signaling公司；細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)及磷酸化(p)-ERK購自美國Santa Cruz公司；磷脂酶(PL)C抗體購自美國Abcam公司。

1.2 原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及分組 取出生24 h內(nèi)的CD-1小鼠大腦皮層，在顯微鏡下剝離腦膜及血管后，將腦組織切碎，加入含20%馬血清的DMEM培養(yǎng)液中，旋渦震蕩1 min。將組織懸液先后用孔徑為80 μm和10 μm的濾膜過濾。將所得到的細胞懸液接種到鋪有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板或60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為含7.5 mmol/L葡萄糖的 DMEM培養(yǎng)基，最初加20%馬血清，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2次，第1周為含20%馬血清的DMEM培養(yǎng)液，第2周為10%馬血清的DMEM培養(yǎng)液，第3周在培養(yǎng)液中加0.25 mmol/L dBcAMP促進細胞分化成熟。將培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞分為對照組、氧化銨組、U73122+氯化銨組、BAPTA+氯化銨組、BGF 109203X+氯化銨組、AG1478+氯化銨組。

1.3 熒光探針技術(shù)測定細胞體積 將蓋玻片上培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞以5 μmol/L Calcein 37℃避光孵育30 min，然后吸棄熒光染料，再用等滲液洗滌細胞2次，以除去細胞外未負載的熒光探針。最后，將細胞置于活細胞熒光顯微鏡載物臺上，檢測細胞內(nèi)Calcein熒光強度(激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為490和535 nm)，以間接反映細胞體積水平。

1.4 免疫凝膠電泳及免疫印跡分析 將含有0.1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液加入培養(yǎng)皿中以獲得全細胞裂解物并利用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法進行蛋白定量。將等量蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并電轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜依次經(jīng)5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃過夜孵育和二抗室溫2 h孵育后，利用增強化學發(fā)光法顯色。利用ImageJ 1.42軟件對條帶灰度進行分析，從而半定量確定各組蛋白的相對表達水平。

1.5 免疫共沉淀 用免疫共沉淀裂解液收集樣品并勻漿。將1 mg蛋白與特異性一抗于4℃、垂直旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下過夜孵育。次日，將protein G加入上述體系繼續(xù)孵育2 h。隨后，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，將獲得的免疫沉淀物與上樣緩沖液混合，100℃變性5 min后，13 000 r/min離心5 s取上清，后續(xù)用于SDS-PAGE電泳及蛋白質(zhì)免疫印跡分析。

1.6 細胞內(nèi)Ca2+瞬變檢測 將5 μmol/L Fura-2 Ca2+熒光探針與蓋玻片上培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞共同避光孵育30 min，充分去除細胞外未負載的熒光探針后，在340和380 nm激發(fā)波長，510 nm發(fā)射波長下，檢測細胞內(nèi)Ca2+水平。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 U73122、BAPTA、GF109203X抑制氨誘導的星形膠質(zhì)細胞水腫 與對照組(1.00±0.04)相比，氯化銨組(1.48±0.17)星形膠質(zhì)細胞相對體積明顯增加(P<0.05)；與氯化銨組比較，U73122+氯化銨組、BAPTA+氯化銨組、GF109203X+氯化銨組(0.98±0.09、1.02±0.14、0.99±0.10)顯著降低(P<0.05)。

2.2 U73122及AG1478抑制氨誘導的細胞內(nèi)Ca2+瞬時增加 與對照組比較，氯化銨組細胞內(nèi)Ca2+(340/380峰值：0.66±0.07)瞬時增加，而U73122+氯化銨組及AG1478+氯化銨組(0.41±0.07、0.41±0.03)顯著低于氯化銨組(均P<0.05)，見圖1。

圖1 各抑制劑對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+水平的影響

2.3 氨刺激增加PLC與EGFR的結(jié)合 與對照組(1.00±0.11)相比，氯化銨組EGFR/PLC(1.82±0.26)顯著增加(P<0.05)，見圖2。

2.4 GF109203X抑制氨誘導的ERK磷酸化 與對照組(1.00±0.12)相比，氨刺激顯著增強ERK的磷酸化(1.87±0.16，P<0.05)。與氯化銨組相比，GF109203X組和GF109203X+氯化銨組(0.98±0.05、1.00±0.12)顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖2 氨對星形膠質(zhì)細胞EGFR/PLC結(jié)合的影響

圖3 GF109203X對星形膠質(zhì)細胞ERK磷酸化的影響

3 討 論

EGFR屬于ErbB受體酪氨酸激酶家族。該家族包含4個密切相關(guān)的成員，即ErbB1/EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4。在靜息狀態(tài)下，EGFR以非活化的形式表達于胞質(zhì)膜。當受到體內(nèi)外環(huán)境中各種因素的刺激后，某些激酶和(或)其特異性配體(該配體往往源于對跨膜前體的蛋白水解釋放)可誘導EGFR的間接激活。激活后的EGFR導致同源或異源二聚體的形成，進而刺激其內(nèi)源性酪氨酸激酶活性，導致其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)特定酪氨酸殘基的磷酸化，最終導致下游信號級聯(lián)的激活〔5〕。因為EGFR在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，故目前對EGFR的研究主要集中于腫瘤領(lǐng)域〔6〕。前期研究顯示EGFR間接激活介導的絲裂原活化蛋白激酶(MEK)/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號級聯(lián)在氨誘導星形膠質(zhì)細胞過程中也起到了至關(guān)重要的作用〔7,8〕。除MEK/ERK和PI3K/AKT信號級聯(lián)外，Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路也是傳遞EGFR活化信號的重要機制〔9〕。細胞內(nèi)Ca2+水平的增加是氨引起星形膠質(zhì)細胞水腫的重要機制之一。Ca2+誘導水腫的機制與其激活Ca2+依賴性的、促進活性氧氮簇(RONS)生成的酶類有關(guān)。這些酶包括還原型輔酶Ⅱ氧化酶(NADPH)、組成型一氧化氮合酶、磷脂酶A2等〔3〕。本研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路各關(guān)鍵分子的抑制劑U73122(針對PLC)、BAPTA(針對Ca2+)、GF109203X(針對PKC)均可顯著抑制氨誘導的星形膠質(zhì)細胞水腫，同時，氨誘導的細胞內(nèi)Ca2+升高可被U73122所抑制，表明該通路的激活參與了氨誘導星形膠質(zhì)細胞水腫的過程。

此外，本文還表明在高氨毒性狀態(tài)下，Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路的激活與EGFR間接激活有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，氨刺激可增加EGFR免疫沉淀物中PLC的水平，表明氨的確有可能促進EGFR與PLC的相互作用。前期研究已顯示，高濃度氨可刺激各信號復(fù)合物Na/K-ATP酶α1、EGFR、Src、ERK、AKT在星形膠質(zhì)細胞胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成的細頸瓶狀特殊膜結(jié)構(gòu)小窩(caveolae)中的集裝，進而導致相關(guān)分子的活化〔7〕。本研究進一步證實，PLC也可能通過加入上述信號復(fù)合物介導下游分子的激活。

研究顯示，在β腎上腺素受體誘導心肌細胞肥大〔10〕及P2X7受體介導神經(jīng)前體細胞神經(jīng)元分化〔11〕等過程中也存在PKC作為上游分子激活ERK的機制〔12，13〕。Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶通路可作為ERK的上游信號分子介導氨誘導細胞水腫的過程。