張亞坤 宋鵬 潘大宇

摘要：植物體攝入過(guò)量的重金屬Cu2+會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，為探討外施Cu2+對(duì)大豆幼苗的毒害機(jī)理，以齊黃35為試驗(yàn)材料，采用盆栽法，以不同濃度（0、20、200、400 μg/g）Cu2+處理液進(jìn)行脅迫，研究外源Cu2+脅迫對(duì)大豆丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶POD）和根莖干鮮質(zhì)量（地上干鮮質(zhì)量和地下干鮮質(zhì)量）的影響。結(jié)果表明，隨著Cu2+脅迫濃度的增加，MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì);對(duì)2種抗氧化酶的活性影響顯著，但活性影響方向不一致，顯著降低SOD活性，增強(qiáng)POD活性，各Cu2+處理下SOD活性與同期對(duì)照組（15 d）相比降低 1.90%～19.55%，POD活性與同期對(duì)照組（15 d）相比增強(qiáng)31.36%～49.45%;Cu2+脅迫顯著降低大豆幼苗地上干質(zhì)量、地上鮮質(zhì)量、地下干質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量，與對(duì)照組相比，400 μg/g濃度的Cu2+脅迫分別下降了55.58%、64.79%、60.31%、85.42%、57.46%、74.79%。Cu2+脅迫引起丙二醛、抗氧化酶和根莖干鮮質(zhì)量的顯著變化，抑制大豆幼苗的正常生長(zhǎng)，丙二醛是Cu2+脅迫的重要表征指標(biāo)，研究為大豆幼苗的Cu2+毒害機(jī)理提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：Cu2+脅迫;活性氧;抗氧化酶;生物量;大豆

中圖分類號(hào)： S565.101? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0089-04

Cu2+是植物體生長(zhǎng)必需的微量元素，參與植物體電子傳遞和光合作用，在植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，但植物組織中過(guò)量的Cu2+會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。有研究報(bào)道，受到Cu2+毒害的植物植株增長(zhǎng)減少、光合作用減弱、礦物質(zhì)元素?cái)z入量下降[1-3]。

植物體攝入過(guò)量的重金屬Cu2+會(huì)使植物活性氧（reactive oxygen species，簡(jiǎn)稱ROS）的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致植物體活性氧的積累進(jìn)而抑制植物生長(zhǎng)并對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。活性氧產(chǎn)生后，會(huì)使植物器官中的膜脂發(fā)生過(guò)氧化，產(chǎn)生過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，簡(jiǎn)稱MDA）[4]。Liu等在玉米和水稻中研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Cu2+能夠增加植物不同組織的丙二醛含量[5-6]。植物可通過(guò)增加抗氧化酶、在根中對(duì)重金屬進(jìn)行螯合等協(xié)調(diào)機(jī)制承受一定程度的Cu2+脅迫[7-8]。這些協(xié)調(diào)機(jī)制中，抗氧化防御系統(tǒng)在降低植物Cu2+毒害方面起著重要的作用[9-10]?？寡趸烙到y(tǒng)通過(guò)相關(guān)酶促和非酶促清除系統(tǒng)的啟動(dòng)，以減輕或消除活性氧積累對(duì)植物的傷害，酶促系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，簡(jiǎn)稱CAT）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，簡(jiǎn)稱POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbata peroxidase，簡(jiǎn)稱APX）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，簡(jiǎn)稱GR），非酶促反應(yīng)主要包括抗壞血酸（ascorbic acid，簡(jiǎn)稱AsA）、類胡蘿卜素（carotenoid，簡(jiǎn)稱Car）以及一些含巰基的低分子化合物等[11-12]。Shashi等在鷹嘴豆和甘藍(lán)型油菜中研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+脅迫能夠增加抗氧化酶活性[13-14]。Liu等在玉米中研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Cu2+脅迫增加過(guò)氧化物酶活性，高濃度的Cu2+脅迫降低過(guò)氧化物酶活性[5]。

近年來(lái)，隨著工業(yè)生產(chǎn)、礦井開(kāi)采和城市活動(dòng)使得農(nóng)業(yè)水源和土壤中富集大量金屬Cu2+，Cu2+脅迫已成為導(dǎo)致作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要因素之一[15]。本研究通過(guò)測(cè)定不同濃度Cu2+處理下大豆幼苗丙二醛含量、酶活性和生物量的變化，探討Cu2+對(duì)大豆幼苗生長(zhǎng)和抗氧化酶的影響，以期為深入闡明植物耐Cu2+機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與生長(zhǎng)環(huán)境

試驗(yàn)品種為齊黃35（審定編號(hào)：國(guó)審豆No.2015005），于2016年10—12月在國(guó)家農(nóng)業(yè)智能裝備工程技術(shù)研究中心小湯山國(guó)家精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)示范基地（116.44°E，40.18°N）中進(jìn)行盆栽培養(yǎng)。挑選顆粒飽滿、大小均一的大豆種子，用1% NaClO溶液消毒15 min，之后用去離子水沖洗3次，用吸水濾紙吸干水分，挑選完好無(wú)損的大豆種子種于盆中，盆中預(yù)先用水澆透，每盆種植10粒種子，種子上覆蓋3 cm厚的干土基質(zhì)?；ㄅ柚睆?5 cm，高20 cm，每個(gè)花盆裝入6 kg的土基質(zhì)（土與育苗基質(zhì)按比例混合）。盆土基質(zhì)基礎(chǔ)肥力為有機(jī)質(zhì)含量為52.6%，全氮含量為1.47%，速效鉀含量為 143 mg/kg，有效磷含量為13.1 mg/kg，pH值為5.5。20 d后挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，每盆留苗4株，共24盆96株。試驗(yàn)期間，溫室內(nèi)溫度保持在15～25 ℃，相對(duì)濕度（RH）為60%～75%，日間光合有效輻射（PAR）為400～800 μmol/（m2·s）。

1.2 Cu2+脅迫處理

Cu2+脅迫參照GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中3個(gè)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)值設(shè)置[16]。采用分析純CuSO4·5H2O制備濃度為0、20、200、400 μg/g的Cu2+處理液備用。試驗(yàn)中設(shè)置4個(gè)Cu2+梯度（表1），每個(gè)梯度均設(shè)置6個(gè)平行試驗(yàn)，即4個(gè)處理6個(gè)重復(fù)24盆盆栽大豆幼苗。

以上處理分別在Cu2+脅迫后5、10、15 d，摘取大豆幼苗頂部第3～5葉位完全成熟的葉片，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行MDA含量和抗氧化酶（SOD、POD）活性測(cè)定。在Cu2+脅迫處理15 d進(jìn)行生物量的測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和數(shù)據(jù)分析

1.3.1 MDA含量和抗氧化酶活性測(cè)定 MDA含量測(cè)定采用趙世杰等改進(jìn)方法[17]。SOD活性測(cè)定采用NBT法（nitrotetrazolium blue chloride，氯化硝基四氮唑藍(lán)法）[18]，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[19]測(cè)定。指標(biāo)測(cè)定時(shí)，每個(gè)處理6次重復(fù)，取平均值。

1.3.2 生物量測(cè)定 處理15 d后，不同處理下的大豆幼苗通過(guò)去離子水沖洗干凈，并用吸水紙吸干附著于樣品上的水分，用剪刀將大豆樣品分為地上和地下部分。用分析天平分別稱取大豆樣品地上部分和根系的鮮質(zhì)量（g/株），然后于105 ℃下殺青0.5 h，再在80 ℃烘干至恒質(zhì)量，分別稱取大豆樣品地上部分和根系的干質(zhì)量（g/株）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Origin軟件制作圖形，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），數(shù)據(jù)顯著性差異運(yùn)用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+脅迫對(duì)大豆幼苗MDA含量的影響

MDA含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后下降趨勢(shì)。不同Cu2+脅迫處理下大豆幼苗葉片MDA含量差異顯著，Cu2+脅迫能夠顯著增加大豆幼苗葉片MDA含量。由圖1可知，處理5 d，Cu2+脅迫濃度在200 μg/g下，大豆幼苗MDA含量與CK相比增幅較小，差異不顯著（P>0.05）;Cu2+脅迫濃度在 400 μg/g 下，大豆幼苗MDA含量顯著升高，與CK相比增加了62.76%。處理10 d，各Cu2+脅迫處理下大豆幼苗MDA含量與CK相比差異均達(dá)到顯著水平（P>0.05），20、200、400 μg/g 下MDA含量與CK相比分別增加了20.6%、54.85%、62.76%，其中Cu2+脅迫濃度在400 μg/g下MDA含量達(dá)到最大值7.2 mmol/g。處理15 d，各Cu2+脅迫處理下大豆幼苗MDA含量與處理10 d相比有所下降，但與CK相比，各處理均達(dá)到顯著水平（P>0.05），20、200、400 μg/g下MDA含量與CK相比分別增加了23.36%、56.53%、61.43%。MDA含量隨Cu2+脅迫濃度的增加而顯著增加，表明外施Cu2+能誘導(dǎo)大豆幼苗MDA含量的升高，MDA含量高表明細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度增加，植物細(xì)胞膜受到的傷害增大。

2.2 Cu2+脅迫對(duì)大豆幼苗抗氧化酶活性的影響

2.2.1 對(duì)大豆幼苗SOD活性的影響 隨著Cu2+脅迫濃度和時(shí)間的延長(zhǎng)，Cu2+脅迫處理能夠顯著降低大豆葉片SOD活性（圖2-A）。處理5 d后，Cu2+脅迫濃度在400 μg/g下SOD活性與CK相比差異達(dá)到顯著水平（P>0.05），大豆幼苗SOD活性降低了19.07%，其他Cu2+脅迫濃度下SOD活性與CK相比差異不顯著。處理10 d，Cu2+脅迫濃度在20 μg/g下SOD活性與CK相比差異不顯著（P>0.05）;Cu2+脅迫濃度在200 μg/g和400 μg/g下SOD活性與CK相比差異達(dá)到顯著水平，與CK相比SOD活性分別降低了20.05%和 24.86%，其中Cu2+脅迫濃度400 μg/g下SOD活性最小，為116.96 U/g。處理15 d，各Cu2+脅迫濃度對(duì)大豆幼苗SOD活性的影響與處理10 d類似，Cu2+脅迫濃度在20 μg/g下SOD活性與CK相比降低了1.90%，但差異未達(dá)到顯著水平（P>0.05）;在200 μg/g和400 μg/g下SOD活性與CK相比分別降低了19.78%和19.55%。

2.2.2 對(duì)大豆幼苗POD活性的影響 隨著Cu2+脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Cu2+脅迫處理能夠顯著增加大豆葉片POD活性（圖2-B）。處理5 d，各Cu2+脅迫下大豆幼苗POD活性與CK相比差異不顯著（P>0.05）。處理10 d，各Cu2+脅迫下大豆幼苗POD活性與CK相比差異均達(dá)到顯著水平（P>0.05），Cu2+脅迫濃度在20、200、400 μg/g下SOD活性與CK

相比分別增加了25.61%、34.49%、42.4%。處理15 d，各Cu2+脅迫濃度對(duì)大豆幼苗POD活性的影響與CK相比差異均達(dá)到顯著水平（P>0.05），分別增加了31.36%、33.94%和49.45%，其中Cu2+脅迫濃度在400 μg/g下POD活性達(dá)到最大，為266.81 U/g。

2.3 Cu2+脅迫對(duì)大豆幼苗生長(zhǎng)和生物量的影響

2.3.1 對(duì)大豆幼苗生長(zhǎng)的影響 Cu2+處理對(duì)大豆幼苗造成的毒害癥狀較明顯，主要表現(xiàn)在莖稈和葉脈會(huì)呈現(xiàn)黃褐色毒害癥狀（圖3）。隨著Cu2+處理時(shí)間的延長(zhǎng)毒害癥狀從植物形態(tài)學(xué)下端向上端蔓延，對(duì)葉片的毒害是從葉片與葉柄連接處開(kāi)始向整個(gè)葉的主脈和側(cè)脈延伸擴(kuò)展。Cu2+處理后10 d，CK與20 μg/g Cu2+脅迫濃度下大豆幼苗生長(zhǎng)狀況類似;200 μg/g Cu2+脅迫濃度下大豆幼苗基部莖稈呈現(xiàn)黃褐色病斑，部分植株中部葉片由葉柄向主葉脈蔓延黃褐色病斑;400 μg/g Cu2+脅迫濃度下嚴(yán)重影響大豆生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，莖稈纖細(xì)、植株矮小，Cu2+毒害蔓延至新生葉片，黃褐色病斑從主葉脈蔓延到側(cè)脈，嚴(yán)重的會(huì)覆蓋整個(gè)大豆葉片，大豆植株基部葉片嚴(yán)重畸形、萎蔫。

2.3.2 對(duì)大豆幼苗生物量的影響 由表2可知，Cu2+脅迫處理顯著抑制大豆幼苗的生長(zhǎng)。Cu2+脅迫濃度在20 μg/g時(shí)，主要抑制大豆幼苗地上部分的生長(zhǎng)，對(duì)幼苗地下鮮質(zhì)量和總鮮質(zhì)量的影響不顯著（P>0.05），與CK相比，對(duì)地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、根干質(zhì)量和總干質(zhì)量影響顯著，分別減少了21.49%、32.39%、33.33%、33.61%。而Cu2+脅迫濃度在200 μg/g時(shí)，對(duì)大豆幼苗地上部分和地下部分生長(zhǎng)均有抑制作用，且差異達(dá)到顯著水平，與CK相比地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、地下干質(zhì)量、總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量分別減少了 38.43%、54.93%、38.13%、70.83%、38.18%、62.18%。隨著脅迫濃度的增加，Cu2+脅迫對(duì)大豆幼苗地上和地下部分生長(zhǎng)的抑制效果越明顯，Cu2+脅迫濃度在400 μg/g下，地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、地下干質(zhì)量、總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量最小，與CK相比分別減少了55.58%、64.79%、60.31%、85.42%、57.46%、74.79%。

3 討論與結(jié)論

銅作為植物正常生命活動(dòng)所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，廣泛參與各種生命活動(dòng)[20]。然而過(guò)量的銅含量將影響植物細(xì)胞代謝和離子平衡，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)[10，21]。正常情況下，植物體內(nèi)存在活性氧清除系統(tǒng)，使植物在生命活動(dòng)中產(chǎn)生的活性氧處于產(chǎn)生和消除的動(dòng)態(tài)平衡，從而使植物免受活性氧傷害。當(dāng)植物處理脅迫逆境時(shí)，活性氧動(dòng)態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生大量活性氧，促使植物脂膜和細(xì)胞器膜的嚴(yán)重過(guò)氧化，MAD含量升高，進(jìn)而導(dǎo)致光合色素含量下降，影響植物的光合作用，因此MDA含量一定程度上能反映植物體活性氧的含量[22]。短時(shí)（5 d）低濃度的Cu2+脅迫20～200 μg/g與同期對(duì)照組相比，MDA含量變化不顯著，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)（10～15 d），低濃度的Cu2+脅迫20～200 μg/g 將會(huì)引起MDA含量的顯著變化;而短時(shí)（5 d）高濃度的Cu2+脅迫400 μg/g與同期對(duì)照組相比，MDA含量差異達(dá)到顯著水平。這可能是因?yàn)槎虝r(shí)低濃度Cu2+脅迫并未破壞植物體內(nèi)活性氧動(dòng)態(tài)平衡，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Cu2+離子脅迫打破植物體內(nèi)活性氧動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，MAD含量升高;而高濃度的Cu2+脅迫迅速破壞植物體內(nèi)活性氧動(dòng)態(tài)平衡，引起MDA含量的顯著升高。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著Cu2+脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA含量逐漸升高（圖1），類似的研究結(jié)論也在玉米[5]、水稻[6]、小麥[23]、棉花[24]、竹子[25]和油菜[14]中發(fā)現(xiàn)，因而膜脂過(guò)氧化可能是Cu2+毒害植物的重要途徑，而MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，因此MDA是表征Cu2+毒害的重要指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，Cu2+脅迫能夠顯著增強(qiáng)POD的活性，這與一些學(xué)者在玉米[26]、穿心蓮[27]的研究結(jié)果一致;低濃度的Cu2+脅迫對(duì)SOD活性的影響不顯著，高濃度的Cu2+脅迫顯著降低SOD活性，這與一些學(xué)者在水稻和空心連中關(guān)于Cu2+脅迫對(duì)SOD活性低促高抑的結(jié)論不一致[6，28]，這可能與植物生長(zhǎng)環(huán)境、脅迫處理時(shí)間和研究作物品種有關(guān)。Cu2+脅迫處理下，2種抗氧化酶SOD和POD活性表現(xiàn)不一，原因是銅對(duì)抗氧化酶活性的影響可能同時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)和抑制2個(gè)方面。一方面，過(guò)量Cu2+明顯提高POD在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，誘導(dǎo)同工酶的表達(dá)，以及對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加工與修飾，提高POD的總活性[29];另一方面，Cu2+脅迫下產(chǎn)生的活性氧可以破壞SOD合成的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而破壞SOD的表達(dá)系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)，降低酶的活性[30]。關(guān)于20～400 μg/g Cu2+脅迫是否促進(jìn)POD同工酶表達(dá)破壞合成SOD的相關(guān)DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是進(jìn)一步研究的方向。

本研究以不同濃度（0、20、200、400 μg/g）Cu2+對(duì)大豆幼苗進(jìn)行脅迫處理，研究外源Cu2+對(duì)大豆幼苗的毒害機(jī)理，分別測(cè)定脅迫處理后5、10、15 d大豆幼苗MDA含量、SOD活性、POD活性和根莖干鮮質(zhì)量等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨著Cu2+脅迫濃度的增加及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA含量升高、SOD活性下降、POD活性升高、根莖干鮮質(zhì)量減少。表明Cu2+脅迫抑制大豆幼苗的正常生長(zhǎng)，MDA是表征Cu2+毒害的重要指標(biāo)，為大豆幼苗的Cu2+毒害機(jī)理提供依據(jù)。

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