李曉娟 周芝熠 王玨 錢源2.3.*

(1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，云南 昆明 650032；2.云南省檢驗醫(yī)學重點實驗室，云南 昆明 650032；3.云南省內(nèi)設研究機構(gòu)實驗診斷研究所，云南 昆明 650032；4.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學 檢驗科，云南 昆明 650032)

子癇前期是妊娠期特有疾病，對母兒健康造成嚴重損害，重度子癇前期是引起孕產(chǎn)婦及新生兒患病率和死亡率增加的主要原因。有研究顯示3%～8%的孕期婦女可發(fā)生子癇前期，并與妊娠期高血壓和蛋白尿有關(guān)[1]。目前子癇前期的發(fā)病機制尚未明確，普遍認為子癇前期是多種因素共同作用的結(jié)果，如滋養(yǎng)細胞功能障礙、子宮螺旋動脈重塑障礙、血管內(nèi)皮細胞廣泛損傷、母胎免疫不耐受等[2]。胎盤娩出后子癇前期病情可明顯好轉(zhuǎn)，提示其病因可能與胎盤相關(guān)。子癇前期不僅危害母體，還可對后代造成不良影響，Kajantie E等[3]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期可通過胎兒宮內(nèi)內(nèi)皮功能障礙增加后代患心血管疾病的概率。早期有效的預測手段將有助于降低子癇前期的發(fā)病率，減輕該病的嚴重性，減少并發(fā)癥及改善圍生期不良結(jié)局。

microRNA 是一類長約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，可以通過與靶mRNA的3'UTR 完全或不完全互補配對結(jié)合，導致靶基因降解或抑制其蛋白質(zhì)翻譯，從而參與基因的表達調(diào)控，在發(fā)育、分化、細胞增殖、凋亡等基本的細胞生物學過程中起重要作用[4]。microRNA對基因進行翻譯后水平的調(diào)節(jié)，Pineles BL等[5]于2007年首次報導胎盤組織中microRNAs差異表達，并提示胎盤中microRNA差異表達可能與子癇前期的病理機制相關(guān)。此后多項研究發(fā)現(xiàn)重度子癇前期患者胎盤組織中microRNA的表達水平顯著高于正常孕婦[6]。最近的一些研究表明microRNA在調(diào)節(jié)胎盤發(fā)育和功能方面起著重要作用[7]。尤其是對于子宮螺旋動脈重鑄、滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲功能、內(nèi)皮功能、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、Ca2+反應及NO產(chǎn)生等方面起調(diào)控作用。本研究通過將重度子癇前期患者microRNA表達譜與正常孕婦的對比篩選，尋找差異表達的microRNA，為探究microRNA在重度子癇前期發(fā)病機制中的作用提供依據(jù)，為探尋新的重度子癇前期診斷標記物及潛在治療靶點提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗組選取2016年在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院分娩的3例重度子癇前期患者。重度子癇前期組的診斷標準按照美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會的要求，以下表現(xiàn)則作為子癇前期的嚴重表現(xiàn)[8]：①收縮壓≥160mmHg或舒張壓≥110mmHg(臥床休息，兩次血壓測量間隔至少4h)；②血小板減少(血小板<100×109/L)；③肝功能損害(血清轉(zhuǎn)氨酶水平為正常參考值2倍以上)，嚴重的持續(xù)右上腹或上腹痛，對藥物治療沒有反應，并排除其他診斷，或兩者兼而有之；④進行性腎功能不全(血清肌酐濃度大于1.1mg/dl(97.2umol/L)或在無其他腎臟疾病的情況下血肌酐濃為正常參考值2倍以上)；⑤肺水腫；⑥新發(fā)生的腦功能或視覺障礙。

1.1.2 對照組選取同時期相同孕產(chǎn)次的3例正?；颊?。

1.1.3 排除標準合并原發(fā)性高血壓、心血管疾病、肝腎疾病、糖尿病、腫瘤、急慢性感染性疾病及胎兒染色體異?；虬l(fā)育畸形等妊娠合并癥病史。所選樣本均經(jīng)過昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，每位研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 胎盤組織處理及microRNA的分離及提取胎盤娩出后，選取胎盤上無鈣化和出血點的部位，從母體面至胎兒面采集數(shù)塊面積約1cm×1cm×1cm的胎盤組織，并用生理鹽水反復漂洗去除血液等，用紗布吸干后加入RNA later后置于-80℃的冰箱保存，準備對等量混合后組織中Total RNA的提取。

1.2.2 microRNA測序分析樣品檢測合格后，使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫，文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至1ng/ul，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，符合預期后使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2nM)。庫檢合格后通過illumina HiSeqTM2500平臺進行高通量測序，測序及結(jié)果分析由北京諾禾致源公司完成。

1.2.3 microRNA數(shù)據(jù)分析對高通量測序結(jié)果進行質(zhì)量評估后用bowtie將長度篩選后的sRNA定位到參考序列上，分析small RNA在參考序列上的分布情況，將上述mapped到參考序列上的reads，與miRBase中指定范圍序列進行比對，得到各樣品匹配上的sRNA的詳細情況。對各樣本中已知和新microRNA進行表達量的統(tǒng)計，并用TPM進行表達量歸一化處理。并對樣品間基因表達水平進行相關(guān)性分析以檢驗實驗可靠性和樣本選擇是合理性。

1.3 microRNA差異表達分析及篩選方法對樣品采用基于負二項分布的DESeq進行分析，從差異倍數(shù)(Fold change)和校正后的顯著水平(padj/qvalue)兩個水平進行評估，以qvalue<0.01 、log2(foldchange)>1為篩選條件對差異microRNA進行篩選。再用火山圖推斷差異microRNA的整體分布情況，將所有比較組合差異microRNA的并集在每個實驗組中的TPM值，用R語言中的pheatmap聚類軟件包進行層次聚類分析。

1.4 microRNA靶基因預測、候選靶基因GO富集分析及KEGG分析使用miRanda軟件(http://www.microrna.org/microrna/home.do)對差異microRNA進行靶基因預測，之后我們對每組差異表達的microRNA靶基因集合通過GOseq方法進行Gene Ontology富集分析，應用KOBAS進行KEGG富集分析，以P<0.05為篩選標準。

2 結(jié)果

2.1 正常孕婦與重度子癇前期患者胎盤組織基因表達水平相關(guān)分析顯示R2=0.975,spearman相關(guān)系數(shù)為0.905，kendall-tau相關(guān)系數(shù)為0.788，表明樣本選擇合理、實驗可靠(圖1)。

圖1 樣品間microRNA表達量相關(guān)性示意圖

橫坐標與縱坐標分別為為樣品的log10(TPM+1)(R2：pearson相關(guān)系數(shù)方；Rho:spearman相關(guān)系數(shù)；Tau：kendall-tau相關(guān)系數(shù))。

2.2 實驗篩選出931個差異表達的microRNA，有41個microRNA符合q value<0.01 、log2(fold change)>1的篩選條件，其中22個表達上調(diào)，19個表達下調(diào)(表1)。差異microRNA火山圖、整體層次聚類圖顯示這些microRNA在兩組中有顯著差異(圖2)。

2.2 對候選靶基因KEGG富集最顯著的20條分析結(jié)果顯示：候選靶基因功能富集通路與Rap1信號通路、雌激素信號通路、焦點黏著、FcγR介導的吞噬作用、調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路、鈣信號通路、炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)的TRP通道、Ras信號通路、TGF-β信號通路的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等相關(guān)見表2。

圖2 差異miRNA火山圖、整體層次聚類圖火山圖：橫坐標代表miRNA在不同實驗組中表達倍數(shù)化，縱坐標代表miRNA表達量變化的統(tǒng)計學顯著程度，圖中的散點代表各個miRNA，藍色圓點表示無顯著性差異的miRNA，紅色圓點表示顯著上調(diào)的差異miRNA，綠色圓點表示顯著下調(diào)的差異miRNA；聚類圖：以log10(TPM+1)值進行聚類，紅色表示高表達miRNA，藍色表示低表達miRNA

microRNA差異倍數(shù)Pq表達調(diào)控hsa-miR-373-3p1.01690.00139980.007363uphsa-miR-433-3p1.02672.6415E-082.02E-07uphsa-miR-205-5p1.02738.038E-752.67E-73uphsa-miR-450b-5p1.13914.9045E-571.27E-55uphsa-miR-144-5p1.1921.48E-1411.1E-139uphsa-miR-450a-5p1.27141.1581E-492.84E-48uphsa-miR-324-5p1.28462.1329E-061.37E-05uphsa-miR-503-5p1.37652.4164E-647.03E-63uphsa-miR-335-3p1.64494.126E-1001.83E-98uphsa-miR-767-5p1.94130.000731910.003939uphsa-miR-378a-5p2.14550.000293440.001646uphsa-miR-1269b6.26442.7481E-132.61E-12uphsa-miR-498-1.00783.3985E-548.55E-53downhsa-miR-29a-3p-1.03238.822E-1537.5E-151downhsa-miR-520a-3p-1.03400downhsa-miR-154-5p-1.05310.000604030.003289downhsa-miR-218-5p-1.10712.5119E-263.6E-25downhsa-miR-146b-5p-1.11192.759E-314.35E-30downhsa-let-7b-5p-1.11554.0015E-336.77E-32downhsa-miR-320a-1.11942.6333E-831.07E-81downhsa-miR-151a-5p-1.12928.5492E-137.96E-12downhsa-miR-521-1.15051.0939E-362.04E-35downhsa-miR-34a-5p-1.22061.2455E-171.43E-16downhsa-miR-483-5p-1.23915.6036E-073.75E-06downhsa-miR-519e-3p-1.34992.0849E-121.87E-11downhsa-miR-376c-3p-1.39343.5137E-396.96E-38downhsa-miR-381-3p-1.42641.428E-2371.5E-235downhsa-let-7e-5p-1.46019.9213E-452.31E-43down

續(xù)表

表2 候選靶基因KEGG富集集最顯著的20條通路

3 討論

子癇前期的發(fā)病機制目前尚未明確，國內(nèi)外多項研究認為其病理根源在于胎盤，胎盤功能障礙與子癇前期發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。子宮螺旋動脈重塑不良、胎盤缺氧、滋養(yǎng)細胞功能障礙、炎癥反應和內(nèi)皮功能障礙在子癇前期發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，目前已有多項關(guān)于子癇前期患者胎盤中microRNA表達譜的研究表明子癇前期胎盤microRNA存在差異表達，且與子癇前期密切相關(guān)[9, 10]?？赏茰y胎盤中過表達的microRNA可能過度降解對子癇前期起抑制作用的靶mRNA，導致相關(guān)蛋白表達下降；相反，低表達的microRNA可能對促進子癇前期發(fā)生發(fā)展的靶mRNA抑制不足，導致相關(guān)蛋白表達上調(diào)。這些差異表達的microRNA可能通過調(diào)節(jié)相應的靶基因，通過不同的信號通路在子癇前期的病理過程中發(fā)揮重要作用。

此次重度子癇前期胎盤差異表達的microRNA候選靶基因功能富集通路與細胞增殖、黏附、遷移、雌激素信號通路、鈣調(diào)節(jié)、炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、TGF-β信號通路等相關(guān)，這些通路異常與子癇前期發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。這些信號通路與胎盤滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲等功能密切相關(guān)，滋養(yǎng)細胞功能障礙可導致螺旋動脈重鑄不良、胎盤淺著床，胎盤缺血、缺氧引起炎癥因子釋放導致內(nèi)皮損傷，誘發(fā)全身血管收縮、體液外滲誘導子癇前期的發(fā)生。其中部分通路已被驗證和子癇前期發(fā)病相關(guān)。Schiessl B等人的研究表明雌激素受體(estrogen receptor, ESR)在子癇前期患者胎盤組織中高表達，ESR可能通過影響滋養(yǎng)細胞的功能參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展[11]。妊娠期母體易缺鈣，細胞內(nèi)Ca2+濃度與血管平滑肌的興奮性有關(guān)，血管內(nèi)皮素(ET-1)可使細胞內(nèi)鈣通道開放，使Ca2+向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，使平滑肌興奮性增加，同時Ca2+還與NO的生成和活性維持有關(guān)，低Ca2+時NO生成減少，這些都可引起血管收縮導致血壓升高[12]。

侵襲性絨毛外滋養(yǎng)細胞重建子宮螺旋動脈可增加血管直徑，使胎盤血流灌注增加，這一過程異?？梢鹛ケP缺氧，導致滋養(yǎng)細胞功能紊亂誘發(fā)子癇前期。此次研究通過對重度子癇前期組及對照組microRNA表達譜進行對比，篩選出了41個差異表達的microRNA。其中大部分microRNA是否與子癇前期發(fā)生、發(fā)展相關(guān)尚未見報導，需進一步研究證實。此次研究發(fā)現(xiàn)在重度子癇前期胎盤中hsa-let-7b-5p和hsa-let-7e-5p表達水平下調(diào)。目前已有關(guān)于let-7家族的研究表明其與子癇前期相關(guān)，但具體機制有待進一步研究。Xu Dai等人[13]研究發(fā)現(xiàn)低表達水平的miR-let-7d除了可促進子癇前期滋養(yǎng)細胞的增殖、分化和侵襲能力，在抑制細胞凋亡方面起著重要作用，miR-Let-7d可能成為子癇治療方法的研究中的潛在靶基因。目前研究發(fā)現(xiàn)Let-7是一種低氧反應性miRNA，低氧條件下let-7水平升高，通過其靶基因AGO1(argonaute 1)上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進血管生成[14, 15]。同時研究發(fā)現(xiàn)let-7c與抗凋亡基因Bcl-xLmRNA結(jié)合，通過抑制Bcl-x L轉(zhuǎn)錄，從而誘導細胞凋亡[16]。缺氧和細胞凋亡都與子癇前期的發(fā)生相關(guān)，hsa-let-7b-5p和hsa-let-7e-5p是否參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展有待進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)胎盤可通過稱為外泌體的小納米囊泡與母體生理學進行交流，胎盤細胞分泌的外泌體在妊娠6周就可從母體循環(huán)中被鑒定出來，并且它們的濃度隨著胎齡的增加而增加[17]。這些信號分子被認為在多泡體與細胞膜進行胞外融合后從母細胞釋放到外泌體中。一旦外泌體被釋放到細胞外空間，一些外泌體就有能力沿著體循環(huán)以非激素信號或通信的形式與體內(nèi)的遠處組織相互作用。由于外泌體在體循環(huán)，它們?yōu)槠鹪唇M織的無創(chuàng)活檢的發(fā)展提供了機會，這為篩選和診斷相關(guān)疾病標志物提供了新的途徑[18]。已有研究證實了組織特異性外泌體在子癇前期診斷中的應用價值，可作為子癇前期潛在的生物標記物[19]。Carlos Salomon等人[20]對無癥狀的婦女外泌體進行檢測，發(fā)現(xiàn)隨后發(fā)展為子癇前期的孕婦血漿中的外泌體濃度明顯大于對照組，認為對母血中存在的胎盤衍生外泌體進行定量，并通過對標記物miR-486-1-5p和miR-486-2-5p表達量檢測，可以及早發(fā)現(xiàn)有子癇前期風險的無癥狀婦女。Lauren Anton等人的研究發(fā)現(xiàn)血清miR-210在子癇前期臨床癥狀出現(xiàn)前數(shù)月就已升高，miR-210有望成為子癇前期新的預測性血清生物標志物，有助于識別高危孕婦[21]。此次研究中差異表達的microRNA尚未行外泌體研究驗證，尚需進一步研究證實它們是否是子癇前期潛在的生物標記物。

子癇前期發(fā)病機制是十分復雜的，發(fā)病過程遠在臨床體征出現(xiàn)之前，因此很難找到識別早期的生物標志物。目前重度子癇前期管理多通過類固醇來誘導胎兒肺成熟和及時分娩結(jié)束妊娠，若能及早預測子癇前期發(fā)生，并提出有效的方法來阻止這一過程，將有助于減少子癇前期及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。通過對子癇前期胎盤組織中差異性表達的microRNA的檢測研究，篩查出差異表達的microRNA并通過進一步研究探索差異表達microRNA與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性，通過檢測相應外泌體水平作為標記物。為妊娠期及早篩查出子癇前期的高危孕婦，進而對其進行干預，改善妊娠結(jié)局提供可能性。通過此方法篩選出子癇前期相關(guān) microRNA有望成為子癇前期預測、診斷的標志物及治療的靶點。